新生仔豬海馬糖皮質(zhì)激素受體及其相關(guān)基因表達(dá)的品種差異與母源性甜菜堿的作用.pdf

1、海馬是參與調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝平衡的中樞，糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid,GC)以及糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor,GR)是介導(dǎo)此調(diào)控效應(yīng)的關(guān)鍵因素，而且海馬發(fā)育也受GC以及GR的調(diào)節(jié)，但這些研究多集中于模式動(dòng)物和細(xì)胞模型。本實(shí)驗(yàn)室以往研究表明不同代謝類(lèi)型豬血清GC基礎(chǔ)水平存在極顯著差異，但對(duì)兩品種豬海馬發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)有何影響尚不清楚，GR及其變體在海馬的表達(dá)模式也不清楚。本研究的目的是比較兩種

2、不同代謝類(lèi)型的新生仔豬海馬發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，分析GR及其變體的表達(dá)模式與GR啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的關(guān)系，研究母源性甜菜堿對(duì)新生仔豬海馬發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響，以及GR及其變體的表達(dá)模式，探討母源性甜菜堿可能的表遺傳作用。
　　1、新生仔豬海馬發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的品種比較
　　以不同代謝類(lèi)型豬代表品種二花臉豬與大白豬的新生仔豬為研究對(duì)象，選擇新生6h以?xún)?nèi)的雄性二花臉豬和大白豬各6頭（江蘇省常州市永康種豬場(chǎng)提供）。仔豬稱(chēng)重記錄，斷頭

3、取血后，立即開(kāi)顱，采集左右兩側(cè)海馬，稱(chēng)重后迅速凍于液氮中，同時(shí)收集血清，凍存于-20℃冰箱。
　　新生大白豬和二花臉豬海馬重量無(wú)明顯差別，但二花臉豬的初生重極顯著低于大白豬(P＜0.01)，二花臉豬海馬體重比則極顯著高于大白豬(P＜0.01)。二花臉豬血清皮質(zhì)醇濃度(P＜0.01)、乳酸水平(P＜0.01)、肌酸激酶活力(P=0.077)均高于大白豬，而二花臉豬血清乳酸脫氫酶活力顯著低于大白豬(P＜0.05);Real-time

4、PCR檢測(cè)海馬發(fā)育相關(guān)的基因mRNA的表達(dá)，結(jié)果表明:BDNF表達(dá)二花臉豬顯著高于大白豬(P＜0.05);細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bax的表達(dá)，二花臉豬顯著低于大白豬(P＜0.05);品種間IGFs的表達(dá)量均無(wú)顯著差異;自噬相關(guān)基因中，二花臉豬海馬MAPlLC3A(P＜0.01)、ATG9A(P=0.06)高于大白豬。與糖皮質(zhì)激素激素代謝相關(guān)的11βHSD1以及11βHSD2的表達(dá)，以及糖皮質(zhì)激素的相關(guān)受體(GR、MR)表達(dá)，品種間都未表現(xiàn)出顯

5、著性差異;二花臉豬海馬GR總蛋白表達(dá)盡管高于大白豬，但差異不顯著(P=0.057)。
　　2、新生仔豬海馬GRmRNA變體表達(dá)及GR啟動(dòng)子DNA甲基化的品種差異
　　Real-time PCR檢測(cè)GRmRNA變體的結(jié)果表明，GR1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9，10、1-11在兩品種豬的海馬內(nèi)均有表達(dá)。但品種間僅GR1-11的表達(dá)有顯著差異，二花臉豬極顯著高于大白豬(P＜0.01)。采用SEQUENOM Mas

6、s Array方法對(duì)GR啟動(dòng)子甲基化進(jìn)行檢測(cè)，聚類(lèi)分析表明同一品種的豬，GR啟動(dòng)子甲基化程度相對(duì)比較一致;在位置上比較接近的點(diǎn)，通常都表現(xiàn)出了非常相似的甲基化水平，比如CPG299和CPG301.302.303，CPG72.73和CpG88。GR啟動(dòng)子CpG242～CpG299區(qū)間的CpG甲基化狀態(tài)與GR1-11的表達(dá)明顯相關(guān);單個(gè)CpG位點(diǎn)的分析表明只有CPG266.267(P＜0.05)和CPG334(P＜0.05)在品種間出現(xiàn)顯著

7、差異，可能與GR1-11的差異表達(dá)有關(guān)。
　　3、母豬日糧添加甜菜堿對(duì)新生仔豬海馬發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　選擇空懷二元雜交母豬12頭（對(duì)照組6頭，甜菜堿組6頭），從配種開(kāi)始直至分娩結(jié)束，對(duì)照組母豬飼喂標(biāo)準(zhǔn)日糧，試驗(yàn)組母豬飼喂的標(biāo)準(zhǔn)日糧中添加3000ppm的甜菜堿。每頭母豬分娩時(shí)，選擇體重中等且相近的兩頭雄性仔豬，稱(chēng)重記錄，斷頭取血后，立即開(kāi)顱，采集左右兩側(cè)海馬，稱(chēng)重后迅速凍于液氮中，同時(shí)收集血清，凍存于-20℃冰箱。

8、r>　　試驗(yàn)組和對(duì)照組新生仔豬海馬重量、海馬重/體重也均無(wú)明顯差別。血清皮質(zhì)醇濃度、乳酸、乳酸脫氫酶以及肌酸激酶活力組間也無(wú)顯著差異。母體添加甜菜堿后，新生仔豬海馬BDNF(P＜0.01)、IGF-1R(P＜0.05)、Bcl-2(P＜0.01)mRNA表達(dá)均顯著提高;自噬相關(guān)基因中，ATG9A(P＜0.05)、ATG6(P＜0.01)、MAP1LC3B(P＜0.01)的表達(dá)也顯著升高。母體添加甜菜堿并沒(méi)有引起新生仔豬11βHSD1、1

9、1βHSD2表達(dá)的改變，但極顯著提高了GRmRNA的表達(dá)(P＜0.01)，GR變體中GR1-4顯著升高(P＜0.05)，GR1-9，10極顯著升高(P＜0.01);GR1-6也具有顯著升高的趨勢(shì)(P=0.077)，但GR總蛋白無(wú)顯著性差異。DNMTs中DNMT1的表達(dá)被顯著提高(P＜0.05)，DNMT3a的表達(dá)也被提高(P=0.06)。
　　4、母豬日糧添加甜菜堿對(duì)新生仔豬海馬GR及自噬相關(guān)基因表達(dá)及表遺傳修飾的影響
　　

10、采用MeDIP方法分析GR以及自噬相關(guān)基因啟動(dòng)子DNA甲基化情況，本試驗(yàn)結(jié)果表明母體添加甜菜堿后，新生仔豬海馬GR1-11啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化存在顯著升高的區(qū)域(P＜0.05);自噬相關(guān)基因(ATG9A、ATG6、MAP1LC3B)啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化狀態(tài)均下降。
　　鑒于GRmRNA與蛋白表達(dá)不一致，可能靶向于GR的miRNA分析表明:母體添加甜菜堿，顯著提高了新生仔豬海馬中miR-181a(P＜0.05)、miR-181d(P