新生仔豬海馬糖皮質(zhì)激素受體及其相關(guān)基因表達的品種差異與母源性甜菜堿的作用.pdf

1、海馬是參與調(diào)節(jié)機體能量代謝平衡的中樞，糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid,GC)以及糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor,GR)是介導(dǎo)此調(diào)控效應(yīng)的關(guān)鍵因素，而且海馬發(fā)育也受GC以及GR的調(diào)節(jié)，但這些研究多集中于模式動物和細胞模型。本實驗室以往研究表明不同代謝類型豬血清GC基礎(chǔ)水平存在極顯著差異，但對兩品種豬海馬發(fā)育相關(guān)基因的表達有何影響尚不清楚，GR及其變體在海馬的表達模式也不清楚。本研究的目的是比較兩種

2、不同代謝類型的新生仔豬海馬發(fā)育相關(guān)基因的表達，分析GR及其變體的表達模式與GR啟動子甲基化狀態(tài)的關(guān)系，研究母源性甜菜堿對新生仔豬海馬發(fā)育相關(guān)基因表達的影響，以及GR及其變體的表達模式，探討母源性甜菜堿可能的表遺傳作用。
　　1、新生仔豬海馬發(fā)育相關(guān)基因表達的品種比較
　　以不同代謝類型豬代表品種二花臉豬與大白豬的新生仔豬為研究對象，選擇新生6h以內(nèi)的雄性二花臉豬和大白豬各6頭（江蘇省常州市永康種豬場提供）。仔豬稱重記錄，斷頭

3、取血后，立即開顱，采集左右兩側(cè)海馬，稱重后迅速凍于液氮中，同時收集血清，凍存于-20℃冰箱。
　　新生大白豬和二花臉豬海馬重量無明顯差別，但二花臉豬的初生重極顯著低于大白豬(P＜0.01)，二花臉豬海馬體重比則極顯著高于大白豬(P＜0.01)。二花臉豬血清皮質(zhì)醇濃度(P＜0.01)、乳酸水平(P＜0.01)、肌酸激酶活力(P=0.077)均高于大白豬，而二花臉豬血清乳酸脫氫酶活力顯著低于大白豬(P＜0.05);Real-time

4、PCR檢測海馬發(fā)育相關(guān)的基因mRNA的表達，結(jié)果表明:BDNF表達二花臉豬顯著高于大白豬(P＜0.05);細胞凋亡相關(guān)基因Bax的表達，二花臉豬顯著低于大白豬(P＜0.05);品種間IGFs的表達量均無顯著差異;自噬相關(guān)基因中，二花臉豬海馬MAPlLC3A(P＜0.01)、ATG9A(P=0.06)高于大白豬。與糖皮質(zhì)激素激素代謝相關(guān)的11βHSD1以及11βHSD2的表達，以及糖皮質(zhì)激素的相關(guān)受體(GR、MR)表達，品種間都未表現(xiàn)出顯

5、著性差異;二花臉豬海馬GR總蛋白表達盡管高于大白豬，但差異不顯著(P=0.057)。
　　2、新生仔豬海馬GRmRNA變體表達及GR啟動子DNA甲基化的品種差異
　　Real-time PCR檢測GRmRNA變體的結(jié)果表明，GR1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9，10、1-11在兩品種豬的海馬內(nèi)均有表達。但品種間僅GR1-11的表達有顯著差異，二花臉豬極顯著高于大白豬(P＜0.01)。采用SEQUENOM Mas

6、s Array方法對GR啟動子甲基化進行檢測，聚類分析表明同一品種的豬，GR啟動子甲基化程度相對比較一致;在位置上比較接近的點，通常都表現(xiàn)出了非常相似的甲基化水平，比如CPG299和CPG301.302.303，CPG72.73和CpG88。GR啟動子CpG242～CpG299區(qū)間的CpG甲基化狀態(tài)與GR1-11的表達明顯相關(guān);單個CpG位點的分析表明只有CPG266.267(P＜0.05)和CPG334(P＜0.05)在品種間出現(xiàn)顯著

7、差異，可能與GR1-11的差異表達有關(guān)。
　　3、母豬日糧添加甜菜堿對新生仔豬海馬發(fā)育相關(guān)基因表達的影響
　　選擇空懷二元雜交母豬12頭（對照組6頭，甜菜堿組6頭），從配種開始直至分娩結(jié)束，對照組母豬飼喂標(biāo)準(zhǔn)日糧，試驗組母豬飼喂的標(biāo)準(zhǔn)日糧中添加3000ppm的甜菜堿。每頭母豬分娩時，選擇體重中等且相近的兩頭雄性仔豬，稱重記錄，斷頭取血后，立即開顱，采集左右兩側(cè)海馬，稱重后迅速凍于液氮中，同時收集血清，凍存于-20℃冰箱。

8、r>　　試驗組和對照組新生仔豬海馬重量、海馬重/體重也均無明顯差別。血清皮質(zhì)醇濃度、乳酸、乳酸脫氫酶以及肌酸激酶活力組間也無顯著差異。母體添加甜菜堿后，新生仔豬海馬BDNF(P＜0.01)、IGF-1R(P＜0.05)、Bcl-2(P＜0.01)mRNA表達均顯著提高;自噬相關(guān)基因中，ATG9A(P＜0.05)、ATG6(P＜0.01)、MAP1LC3B(P＜0.01)的表達也顯著升高。母體添加甜菜堿并沒有引起新生仔豬11βHSD1、1

9、1βHSD2表達的改變，但極顯著提高了GRmRNA的表達(P＜0.01)，GR變體中GR1-4顯著升高(P＜0.05)，GR1-9，10極顯著升高(P＜0.01);GR1-6也具有顯著升高的趨勢(P=0.077)，但GR總蛋白無顯著性差異。DNMTs中DNMT1的表達被顯著提高(P＜0.05)，DNMT3a的表達也被提高(P=0.06)。
　　4、母豬日糧添加甜菜堿對新生仔豬海馬GR及自噬相關(guān)基因表達及表遺傳修飾的影響
　　

10、采用MeDIP方法分析GR以及自噬相關(guān)基因啟動子DNA甲基化情況，本試驗結(jié)果表明母體添加甜菜堿后，新生仔豬海馬GR1-11啟動子區(qū)DNA甲基化存在顯著升高的區(qū)域(P＜0.05);自噬相關(guān)基因(ATG9A、ATG6、MAP1LC3B)啟動子區(qū)DNA甲基化狀態(tài)均下降。
　　鑒于GRmRNA與蛋白表達不一致，可能靶向于GR的miRNA分析表明:母體添加甜菜堿，顯著提高了新生仔豬海馬中miR-181a(P＜0.05)、miR-181d(P