擬態(tài)弧菌模擬表位的串聯表達及其草魚的免疫應答研究.pdf

1、擬態(tài)弧菌可引起水產動物的腹水病,嚴重危害水產養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展,但目前尚無疫苗用于該病預防。本實驗室前期研究已證實外膜蛋白U(OmpU)是擬態(tài)弧菌保守性黏附素蛋白之一,該蛋白對實驗小鼠的免疫保護率為60％。同時,篩選鑒定出OmpU蛋白的6個免疫優(yōu)勢B細胞模擬表位,但模擬表位串聯肽的免疫效應尚不清楚。本研究的總體思路是設計和表達OmpU蛋白模擬表位串聯肽,綜合評價其免疫效應,以期獲得免疫保護效應較OmpU蛋白有所提高的多表位肽。
　　

2、首先,根據OmpU蛋白模擬表位序列及多表位串聯肽設計原則,優(yōu)化設計模擬表位串聯肽。即用AAY(丙氨酸-丙氨酸-酪氨酸)接頭將已鑒定獲得的OmpU蛋白6個模擬表位按不同方式串聯,應用DNAStarProtean軟件分析各種串聯方式的可行性,結果發(fā)現以C25-AAY-C17-AAY-C60-AAY-C20-AAY-C66-AAY-C24方式排列的多表位肽中各表位間相對獨立,抗原性參數較好,為最佳串聯方式。將此多表位串聯肽序列轉化為基因序列,

3、并在基因序列兩端添加酶切位點,終止密碼子以及替換稀有密碼子,形成一個長度為264bp的多表位串聯基因(命名為6epis基因),委托生物公司克隆至質粒pMAL-c4X中。
　　其次,大量制備模擬表位串聯肽,為綜合評價其免疫效應提供試驗材料。應用基因重組技術構建重組表達質粒pET-32a-6epis,轉化至E.coliRosetta進行大量誘導表達,進而使用Ni-ChargedResin親合層析柱純化重組蛋白His-6EPIS。經SD

4、S-PAGE和Western-blot分析,發(fā)現制備的重組蛋白濃度為1.5mg/mL,純度達到95%,能與兔抗OmpU抗體發(fā)生特異性反應,仍保留天然蛋白的抗原性。
　　最后,以制備的重組模擬表位串聯蛋白、重組OmpU蛋白、標簽蛋白和滅活菌苗分別免疫實驗魚,通過測定免疫器官中免疫相關基因表達水平、血清抗體產生水平和免疫動物的保護水平,綜合評價其免疫效應。結果顯示:(1)6EPIS免疫組草魚頭腎和脾臟中IgMmRNA的表達水平具有明顯

5、時間依賴性,免疫后3d開始逐漸升高,至28d達到高峰,攻毒后頭腎和脾臟中IgMmRNA表達水平迅速上升,分別較免疫前提高28倍和54倍(p<0.01)。OmpU組、滅活菌組和標簽蛋白組草魚免疫后組織中IgMmRNA轉錄水平的動力學與重組6EPIS組相似,兩因素方差分析結果表明:重組6EPIS組頭腎和脾臟中IgMmRNA轉錄整體水平均顯著高于重組OmpU組、滅活菌組和His標簽蛋白組的頭腎和脾臟(p<0.05),而重組OmpU組、滅活菌組

6、和His標簽蛋白組的IgMmRNA轉錄整體水平無顯著差異(p>0.05)。(2)草魚頭腎和脾臟中促炎細胞因子(IL-1β和TNF-α)mRNA表達水平于首次免疫和加強免疫后的第1d上調至極顯著水平(p<0.001),但攻毒后的表達水平與對照組差異不顯著(p>0.05)。重組6EPIS組促炎細胞因子的整體轉錄水平顯著高于重組OmpU組、滅活菌組和標簽蛋白組(p<0.01),且重組OmpU組和滅活菌組均顯著高于標簽蛋白組(p<0.01),但

7、兩組之間差異不顯著(p>0.05)。(3)免疫草魚脾臟和頭腎中抗炎性細胞因子IL-10mRNA表達水平輕微下調,但在攻毒后,表達水平顯著上調(p<0.01),6EPIS組、OmpU組、滅活菌組促炎細胞因子的整體轉錄水平顯著高于標簽蛋白組(p<0.01),但是三組之間的差異不顯著(p>0.05)。(4)重組模擬表位串聯蛋白能夠良好誘導魚體產生特異性抗體,其免疫后28天瓊擴效價為1:16,同時,OmpU組和滅活菌組的血清抗體效價為1:4和1