PRRSV結構蛋白的表達及其激活有效免疫應答的研究.pdf

1、目的：對豬繁殖與呼吸綜合征病毒PRRSV表面蛋白GP2、GP3、GP4與GP5進行高效原核表達,純化后進行動物免疫試驗,比較GP2、GP3、GP4、GP5及其組合的免疫學效應,探討其作為疫苗候選主要抗原的可能性
　　方法：根據(jù)Genbank中豬繁殖與呼吸綜合征病毒PRRSV JXA1株的已知序列,利用RT-PCR方法擴增PRRSV ORF2、ORF3、ORF4和ORF5基因,分別插入原核表達載體 PET-32a,轉化 E.coli

2、進行高效誘導表達,經親和層析純化后進行SDS-PAGE和Western blotting實驗,鑒定正確的GP2、GP3、GP4、GP5純化蛋白按不同的組合方式,添加佐劑后對小鼠進行單獨免疫和聯(lián)合免疫,檢測免疫原性;使用生物學信息學技術,根據(jù)已知目的蛋白的序列對目的蛋白的結構、同源性、抗原性作預測和分析。
　　結果：1) RT-PCR、酶切和測序結果顯示目的基因克隆成功且無突變, SDS-PAGE和Western blotting鑒

3、定結果中,均可觀察到特異性目的條帶,表明本實驗正確表達了PRRSV表面蛋白GP2、GP3、GP4與GP5,并且親和層析實驗后的GP2~5蛋白純度可達到90％。2)使用純化后的GP2~5四種蛋白對Balb/c小鼠進行腹腔免疫試驗,實驗過程中小鼠沒有死亡,表面重組蛋白的安全性;收集小鼠血清對免疫結果進行檢測分析并比對后顯示,四種蛋白均具有免疫源性,可刺激機體產生良好的免疫應答,其中,GP2的抗體效價最低,GP5抗體效價最高, GP2、GP3

4、、GP4同時免疫的抗體效價與GP5相接近,而GP2、GP3、GP4、GP5同時免疫后具有相對更高水平的抗體效價。3)三免1周后四種蛋白誘導的IgG水平明顯升高,且均誘導產生了sIgA;實驗組 IgG1和 IgG2a的檢測結果均高于PBS組,且水平相對接近;同時檢測到分泌的細胞因子IFN-γ和IL-4水平,結果表明四種表面蛋白GP2~5刺激機體同時誘導了體液和細胞免疫應答。
　　結論：表達出PRRSV JXA1株表面蛋白GP2、GP

5、3、GP4與GP5,作為亞單位疫苗的候選抗原進行免疫檢測。通過單獨免疫試驗顯示,PRRSV四種表面蛋白均有免疫原性,但免疫原性差距較大。通過聯(lián)合免疫試驗顯示,GP2、GP3、GP4三種蛋白聯(lián)合免疫與GP5蛋白單獨免疫后的檢測結果沒有明顯差異,說明GP2、GP3、GP4三種結構蛋白是以三聚體形式共同參與了免疫應答反應。綜合結果表明,GP5可單獨作為保護性抗原制備疫苗,GP2、GP3、GP4不適合單獨作為保護性抗原制備疫苗;而GP5與GP2