利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增和Padlock探針技術(shù)檢測(cè)瓜蔓枯病菌.pdf

1、植物病原茵的檢測(cè)與鑒定技術(shù)的研究是我國(guó)各口岸檢驗(yàn)工作的重點(diǎn)，對(duì)阻止外來(lái)有害生物的入侵從而保護(hù)我國(guó)農(nóng)林業(yè)經(jīng)濟(jì)安全生產(chǎn)活動(dòng)與生態(tài)安全有著重要的意義。目前為止傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)及現(xiàn)有的分子檢測(cè)技術(shù)如傳統(tǒng)PCR技術(shù)已無(wú)法滿足上述要求，因此尋找其他更加穩(wěn)定和特異的的檢測(cè)靶標(biāo)，并建立新的檢測(cè)技術(shù)體系，變得越來(lái)越重要。
　　本研究通過(guò)分別利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)和Padlock探針（同時(shí)結(jié)合了斑點(diǎn)雜交）技術(shù)這兩種分子檢測(cè)手段檢測(cè)了瓜蔓枯病

2、的病原真菌(Didymellabryoniae)并建立了其高效的檢測(cè)體系。本研究的LAMP引物和Padlock探針的靶標(biāo)位點(diǎn)選擇的是看家基因之一的RNA聚合酶Ⅱ(RPB2)基因，并對(duì)這些引物和探針的特異性和靈敏度進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)中所使用的特異性引物和探針均可達(dá)到特異性檢測(cè)特定病原茵的目的，并且其檢測(cè)的靈敏度達(dá)到反應(yīng)體系中DNA最低濃度閥值:200fg，較普通的PCR檢測(cè)手段高出100倍，完全滿足了檢驗(yàn)工作的需求。同時(shí)，

3、通過(guò)本實(shí)驗(yàn)室從全國(guó)各地收集的西瓜和甜瓜藤蔓樣品的實(shí)際檢測(cè)應(yīng)用，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這兩種檢測(cè)手段都能很好的從33份樣品中檢測(cè)出17份。
　　本研究使用的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)周期短只需1h，靈敏度高，并且在反應(yīng)過(guò)程中不涉及模板的變性與退火，所以不需要熱循環(huán)儀，只需恒溫水浴鍋即可完成實(shí)驗(yàn)，加之反應(yīng)結(jié)果肉眼可見。同時(shí)，Padlock探針技術(shù)也具有耗時(shí)短，靈敏度高以及易操作的特點(diǎn)，再結(jié)合斑點(diǎn)雜交技術(shù)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)顯色反映變得可視化，且保證了結(jié)