基于環(huán)介導等溫擴增技術的大豆南、北方莖潰瘍病菌檢測技術體系.pdf

1、大豆莖潰瘍病是大豆生產(chǎn)上的重要病害。大豆莖潰瘍的病原菌分為大豆南方莖潰瘍病菌[Diaporthe phaseolorum(Cke.& Ell.) Sacc.var.meridionalis Morgan-Jones](簡稱DPM)和大豆北方莖潰瘍病菌[Diaporthe phaseolorum var.caulivora]（簡稱DPC）。大豆南、北方莖潰瘍病菌都屬于子囊菌亞門、球殼目、間座殼科、間座殼屬，無性階段均為擬莖點霉屬。能與大豆

2、莖莢枯病菌和大豆擬莖點種腐病菌共同引起間座殼—擬莖點綜合癥，危害非常嚴重。由DPM和DPC分別引起的大豆南方莖潰瘍病和大豆北方莖潰瘍病在我國還未有發(fā)生的報道，這兩種病害均為我國口岸的檢疫病害。
　　由于我國對大豆的需求量越來越大，而進口大豆中除大豆種子以外還混雜有豆莢、豆稈、碎葉片、以及田間的泥塊等殘渣，若這些成分中含有活著的大豆南、北方莖潰瘍病菌，則很有可能由于目前口岸對這兩種病原菌的檢測技術較為落后而造成檢測漏洞。若不能及時發(fā)

3、現(xiàn)和阻止帶菌大豆入境，使這兩種病原菌在我國定殖、傳播和危害，將會對我國的大豆生產(chǎn)產(chǎn)生嚴重影響。
　　目前我國口岸對大豆南、北方莖潰瘍病菌的檢測技術還不是十分成熟，即使可以檢測，也要花費較長時間，并且對人力、物力、所需儀器、實驗條件等也有很高的要求。而口岸檢疫最重要的一點就是病原菌的快速、準確的診斷。為此，本實驗主要是基于環(huán)介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)建立

4、一種口岸DPM、DPC快速檢測的技術體系。該技術體系由本實驗室鄭小波、沈浩等研發(fā)。
　　由于進境的大豆殘渣樣本中含有豆莢、豆稈、碎葉片、多種微生物及田間的泥塊等成分，那么該LAMP技術是否能在這些影響因素存在的情況下，準確的檢測出材料中的DPM、DPC呢？所以我們首先在實驗室條件下，采用向一定量的江蘇省出入境檢驗檢疫局提供的不含有DPM、DPC的大豆殘渣樣本中加入不同濃度梯度的DPM、DPC的孢子的方法對LAMP檢測DPM、DPC

5、的靈敏度進行研究。基于LAMP的DPM、DPC的檢測靈敏度越高就越有利于提高在口岸檢疫這兩種病菌的檢出效率。我們最終確定了在實驗室條件下應用該LAMP技術檢測DPM、DPC的靈敏度，分別為10～50個孢子/10g大豆殘渣、1～10個孢子/10g大豆殘渣。
　　在確定了在實驗室條件下研發(fā)的該LAMP的DPM、DPC快速分子檢測隨技術可應用于口岸截獲的大豆殘渣樣本的檢測后，我們就對江蘇省出入境檢驗檢疫局提供的口岸截獲的11份大豆殘渣樣

6、本進行DPM、DPC的LAMP實際檢測。檢測出該11份豆渣樣本中有3份攜帶有DPC、均未攜帶DPM。
　　病菌的傳播是建立在活體的基礎上。江蘇省出入境檢驗檢疫局提供的11份大豆殘渣樣本進行DPM、DPC的LAMP檢測后，對DPC檢測結(jié)果為陽性的有3份豆渣樣本。但并不清楚是否含有DPC活菌。所以，我們對該3份大豆殘渣樣本中攜帶的DPC進行分離、純化。最后從2號（巴西，201304005）大豆殘渣樣本中分離出了DPC。
　　本實