電刺激誘導櫛孔扇貝(Chlamys farreri)雌核發(fā)育的參數(shù)優(yōu)化及細胞學分析.pdf

1、人工誘導雌核發(fā)育(artificial induction of gynogenesis)是指采用物理、化學或生物方法，在雄核不參與合子形成的情況下，卵子依靠自身雌核的遺傳物質(zhì)發(fā)育成胚胎的技術(shù)過程。開展人工誘導雌核發(fā)育的研究，對快速建立純系，并進而開展遺傳育種研究具有重要價值。此外，雌核發(fā)育后代由于其遺傳物質(zhì)完全來源于母本一方，所以也是研究性別遺傳機制、基因-著絲粒重組、基因作圖及克隆的珍貴材料。本研究選取我國北方的主要養(yǎng)殖貝類櫛孔扇貝

2、作為研究對象，首次采用電刺激的方法誘導櫛孔扇貝的雌核發(fā)育，并對誘導條件進行了參數(shù)優(yōu)化。利用Hoechst染色法，觀察了電刺激誘導后卵內(nèi)早期核相的變化，并利用流式細胞儀法和染色體計數(shù)法對所得雌核發(fā)育胚胎的倍性進行了分析。
　　 1、電刺激誘導的參數(shù)優(yōu)化：為獲得誘導櫛孔扇貝雌核發(fā)育的最優(yōu)電刺激條件，本實驗選取了影響電刺激誘導的五個主要因素：電場強度、電容、脈沖次數(shù)、卵子密度及電刺激緩沖液的種類，采用正交設(shè)計的方法，分別研究了這五個因

3、素對誘導櫛孔扇貝雌核發(fā)育的影響并篩選最優(yōu)的條件組合。具體結(jié)果如下：
　　 (1)電刺激緩沖液的選擇。設(shè)定電刺激誘導條件為場強0.98 kv/cm，電容3μF，2次電脈沖，測試3種緩沖液(甘露醇、山梨醇和Zimmerman氏)在3種濃度梯度(0.25 mol/L，0.30 mol/L和0.35 mol/L)下的卵裂率。結(jié)果顯示：在配制以上3種電刺激緩沖液時，甘露醇、山梨醇和蔗糖的濃度分別選用0.30 mol/L，0.25mol/L

4、和0.30mol/L時，獲得的卵裂率最高。將電刺激緩沖液、場強和電容設(shè)計三因子正交實驗，比較不同電刺激緩沖液的誘導效果，結(jié)果表明不同緩沖液的誘導效果差異不顯著(p>0.05)，但甘露醇緩沖液的誘導效果優(yōu)于Zimmerman氏緩沖液和山梨醇緩沖液。因此后續(xù)實驗都選用濃度為0.30 mol/L的甘露醇電刺激緩沖液。
　　 (2)卵子密度值的優(yōu)化。對卵子密度、場強及電容采用L9(34)正交實驗設(shè)計，對統(tǒng)計結(jié)果進行分析得到，在中高度場強

5、(1.30kv/cm和1.62 kv/cm)下，卵裂率隨卵子密度值的增加而呈上升趨勢，最佳卵子密度是11.25×104個/ml，
　　 結(jié)合1.30 kv/cm的場強和10μF的電容時得到的雌核發(fā)育卵裂率高達27.46％。
　　 (3)場強對誘導效果的影響。單因子分析法結(jié)果表明，從0.75 kv/cm到1.13kv/cm，隨著場強的增加，卵裂率逐步上升，1.13 kv/cm時卵裂率達最大，然后隨著場強繼續(xù)增加，卵裂率顯著

6、下降(p<0.05)。初步確定場強的最適范圍是1.00到1.75 kv/cm。
　　 (4)電容值的優(yōu)化及最優(yōu)參數(shù)組合的篩選。對場強、電容及脈沖次數(shù)使用L9(34)正交實驗設(shè)計，得到不同電容梯度對雌核發(fā)育誘導率的影響差異極顯著，其中3μF的誘導效果最佳，25μF的誘導效果最差。同時篩選得到的最優(yōu)參數(shù)組合是：密度值為11.25×104個/ml，使用0.30 mol/L的甘露醇緩沖液，電場強度1.20 kv/cm，電容3μF，2次電

7、脈沖，此時的卵裂率是28.16％，胚胎存活率達98.37％。
　　 2、雌核發(fā)育胚胎的細胞學分析：
　　 (1)胚胎發(fā)育情況檢測。電刺激能誘導櫛孔扇貝卵子的雌核發(fā)育，普通光學顯微鏡下觀察到，電刺激處理后部分卵子發(fā)生卵裂，但是發(fā)育滯緩，而且電刺激處理后卵膜易脫落，卵子易畸形。
　　 (2)早期胚胎的核相變化分析。通過Hoechst染色觀察，發(fā)現(xiàn)胚胎發(fā)育時間滯后，大部分激活的卵子進入正常的卵裂進程，只有少數(shù)出現(xiàn)只排一