電刺激誘導(dǎo)櫛孔扇貝(Chlamys farreri)雌核發(fā)育的參數(shù)優(yōu)化及細(xì)胞學(xué)分析.pdf

1、人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育(artificial induction of gynogenesis)是指采用物理、化學(xué)或生物方法，在雄核不參與合子形成的情況下，卵子依靠自身雌核的遺傳物質(zhì)發(fā)育成胚胎的技術(shù)過程。開展人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育的研究，對(duì)快速建立純系，并進(jìn)而開展遺傳育種研究具有重要價(jià)值。此外，雌核發(fā)育后代由于其遺傳物質(zhì)完全來源于母本一方，所以也是研究性別遺傳機(jī)制、基因-著絲粒重組、基因作圖及克隆的珍貴材料。本研究選取我國北方的主要養(yǎng)殖貝類櫛孔扇貝

2、作為研究對(duì)象，首次采用電刺激的方法誘導(dǎo)櫛孔扇貝的雌核發(fā)育，并對(duì)誘導(dǎo)條件進(jìn)行了參數(shù)優(yōu)化。利用Hoechst染色法，觀察了電刺激誘導(dǎo)后卵內(nèi)早期核相的變化，并利用流式細(xì)胞儀法和染色體計(jì)數(shù)法對(duì)所得雌核發(fā)育胚胎的倍性進(jìn)行了分析。
　　 1、電刺激誘導(dǎo)的參數(shù)優(yōu)化：為獲得誘導(dǎo)櫛孔扇貝雌核發(fā)育的最優(yōu)電刺激條件，本實(shí)驗(yàn)選取了影響電刺激誘導(dǎo)的五個(gè)主要因素：電場(chǎng)強(qiáng)度、電容、脈沖次數(shù)、卵子密度及電刺激緩沖液的種類，采用正交設(shè)計(jì)的方法，分別研究了這五個(gè)因

3、素對(duì)誘導(dǎo)櫛孔扇貝雌核發(fā)育的影響并篩選最優(yōu)的條件組合。具體結(jié)果如下：
　　 (1)電刺激緩沖液的選擇。設(shè)定電刺激誘導(dǎo)條件為場(chǎng)強(qiáng)0.98 kv/cm，電容3μF，2次電脈沖，測(cè)試3種緩沖液(甘露醇、山梨醇和Zimmerman氏)在3種濃度梯度(0.25 mol/L，0.30 mol/L和0.35 mol/L)下的卵裂率。結(jié)果顯示：在配制以上3種電刺激緩沖液時(shí)，甘露醇、山梨醇和蔗糖的濃度分別選用0.30 mol/L，0.25mol/L

4、和0.30mol/L時(shí)，獲得的卵裂率最高。將電刺激緩沖液、場(chǎng)強(qiáng)和電容設(shè)計(jì)三因子正交實(shí)驗(yàn)，比較不同電刺激緩沖液的誘導(dǎo)效果，結(jié)果表明不同緩沖液的誘導(dǎo)效果差異不顯著(p>0.05)，但甘露醇緩沖液的誘導(dǎo)效果優(yōu)于Zimmerman氏緩沖液和山梨醇緩沖液。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)都選用濃度為0.30 mol/L的甘露醇電刺激緩沖液。
　　 (2)卵子密度值的優(yōu)化。對(duì)卵子密度、場(chǎng)強(qiáng)及電容采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行分析得到，在中高度場(chǎng)強(qiáng)

5、(1.30kv/cm和1.62 kv/cm)下，卵裂率隨卵子密度值的增加而呈上升趨勢(shì)，最佳卵子密度是11.25×104個(gè)/ml，
　　 結(jié)合1.30 kv/cm的場(chǎng)強(qiáng)和10μF的電容時(shí)得到的雌核發(fā)育卵裂率高達(dá)27.46％。
　　 (3)場(chǎng)強(qiáng)對(duì)誘導(dǎo)效果的影響。單因子分析法結(jié)果表明，從0.75 kv/cm到1.13kv/cm，隨著場(chǎng)強(qiáng)的增加，卵裂率逐步上升，1.13 kv/cm時(shí)卵裂率達(dá)最大，然后隨著場(chǎng)強(qiáng)繼續(xù)增加，卵裂率顯著

6、下降(p<0.05)。初步確定場(chǎng)強(qiáng)的最適范圍是1.00到1.75 kv/cm。
　　 (4)電容值的優(yōu)化及最優(yōu)參數(shù)組合的篩選。對(duì)場(chǎng)強(qiáng)、電容及脈沖次數(shù)使用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到不同電容梯度對(duì)雌核發(fā)育誘導(dǎo)率的影響差異極顯著，其中3μF的誘導(dǎo)效果最佳，25μF的誘導(dǎo)效果最差。同時(shí)篩選得到的最優(yōu)參數(shù)組合是：密度值為11.25×104個(gè)/ml，使用0.30 mol/L的甘露醇緩沖液，電場(chǎng)強(qiáng)度1.20 kv/cm，電容3μF，2次電

7、脈沖，此時(shí)的卵裂率是28.16％，胚胎存活率達(dá)98.37％。
　　 2、雌核發(fā)育胚胎的細(xì)胞學(xué)分析：
　　 (1)胚胎發(fā)育情況檢測(cè)。電刺激能誘導(dǎo)櫛孔扇貝卵子的雌核發(fā)育，普通光學(xué)顯微鏡下觀察到，電刺激處理后部分卵子發(fā)生卵裂，但是發(fā)育滯緩，而且電刺激處理后卵膜易脫落，卵子易畸形。
　　 (2)早期胚胎的核相變化分析。通過Hoechst染色觀察，發(fā)現(xiàn)胚胎發(fā)育時(shí)間滯后，大部分激活的卵子進(jìn)入正常的卵裂進(jìn)程，只有少數(shù)出現(xiàn)只排一