櫛孔扇貝(Chlamys farreri)EST-SNP的開發(fā)及其應(yīng)用.pdf

1、櫛孔扇貝(Chlamys fareri)是我國(guó)重要經(jīng)濟(jì)海水養(yǎng)殖貝類之一,近年來養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)了病害頻發(fā)、大規(guī)模死亡、個(gè)體小型化等問題,為此,進(jìn)行品質(zhì)優(yōu)良、高產(chǎn)、生長(zhǎng)迅速、抗病、抗逆新品種的選育成為其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)。分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)和基于分子標(biāo)記的功能基因研究為優(yōu)良品種的培育提供了理論基礎(chǔ)和有效途徑。為此,本研究以櫛孔扇貝為主要研究材料,探討了櫛孔扇貝EST-SNP標(biāo)記的有效篩選條件及其在櫛孔扇貝遺傳育種中的應(yīng)用。

2、>　　1.櫛孔扇貝EST-SNP分型技術(shù)的建立及標(biāo)記的篩查和評(píng)價(jià)本研究針對(duì)HRM非標(biāo)記探針技術(shù)進(jìn)行改進(jìn),利用3'端非配對(duì)堿基進(jìn)行探針的末端封閉,并對(duì)利用HRM非標(biāo)記探針技術(shù)進(jìn)行EST-SNP篩查的流程進(jìn)行優(yōu)化,建立了一套高靈敏度、低成本篩查EST-SNP的技術(shù)體系。利用該技術(shù)體系,首次進(jìn)行了大規(guī)模EST-SNP標(biāo)記的開發(fā),從櫛孔扇貝5630個(gè)候選SNP位點(diǎn)中,成功篩選出1696個(gè)多態(tài)性SNP標(biāo)記,并利用青島群體對(duì)其進(jìn)行了評(píng)價(jià),次要等位基

3、因頻率在0.010-0.500之間,觀測(cè)雜合度和期望雜合度分別介于0.000-0.942和0.020-0.507,所有的位點(diǎn)均處于連鎖平衡狀態(tài),102個(gè)位點(diǎn)偏離哈代-溫伯格平衡。這些位點(diǎn)將為櫛孔扇貝的遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、功能基因分析、QTL定位等奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　同時(shí)以本研究結(jié)果為依據(jù),提出了進(jìn)行EST-SNP篩選時(shí),為提高多態(tài)性位點(diǎn)的篩選比例,應(yīng)優(yōu)先選擇含4條以上EST序列的contig大小、次要等位基因頻數(shù)在2以上并且次要等

4、位基因頻率高于25％的位點(diǎn)作為候選位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。
　　2.EST-SNP的種間通用性研究本研究進(jìn)行了扇貝中EST-SNP的通用性研究,利用在櫛孔扇貝中篩選得到的34個(gè)多態(tài)性EST-SNP標(biāo)記,在五個(gè)近源種扇貝(華貴櫛孔扇貝Chlamysnobilis、海灣扇貝Argopectens irradias、日月貝Amusium pleuronectes、蝦夷扇貝Patinopectenyessoensis、紫扇貝Argopecten

5、 purpuratus)中進(jìn)行了通用性驗(yàn)證。結(jié)果顯示有19個(gè)位點(diǎn)可以在至少一種近源扇貝中表現(xiàn)出多態(tài)性,其中2個(gè)位點(diǎn)在4種扇貝中保持多態(tài)性。研究結(jié)果表明,EST來源的SNP標(biāo)記具有較好的通用性,并且統(tǒng)計(jì)顯示通用性較好的SNP位點(diǎn)多位同義突變,而非同義突變則在種間較難通用。
　　3.櫛孔扇貝任意BSA群體選擇性基因分型為了進(jìn)行與表型相關(guān)基因的發(fā)掘,為分子標(biāo)記輔助提供理論基礎(chǔ)和參考數(shù)據(jù),本研究在櫛孔扇貝兩個(gè)自然群體中選擇殼高極大和極小的

6、個(gè)體組成任意BSA群體,利用1696個(gè)EST-SNP標(biāo)記,進(jìn)行了選擇性基因分型,掃描與殼高相關(guān)的基因。研究發(fā)現(xiàn),有12個(gè)位點(diǎn)在殼高極大和殼高極小群體間存在基因頻率和(或)基因型頻率差異,其中6個(gè)位點(diǎn)存在基因頻率的差異,6個(gè)位點(diǎn)基因頻率差異不顯著但基因型頻率差異顯著。掃描結(jié)果對(duì)于進(jìn)行櫛孔扇貝殼高決定基因的研究、以殼高性狀為目標(biāo)的選種選育奠定了基礎(chǔ)。
　　4.櫛孔扇貝EST-SNP雄性遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建利用具有共父關(guān)系的三個(gè)全同胞家系

7、、一個(gè)父系半同胞家系和285個(gè)EST-SNP標(biāo)記成功進(jìn)行了櫛孔扇貝雄性遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建。所構(gòu)建的圖譜圖譜總長(zhǎng)度為2025.4 cM,圖譜覆蓋度約為87.1％。標(biāo)記間最大間隔為25.8cM,最小間隔為0.0cM,平均間隔為7.70cM;最長(zhǎng)連鎖群234.5 cM,連鎖群最短22.3cM,平均長(zhǎng)度為106.6cM;連鎖群上的分子標(biāo)記數(shù)目最多為44個(gè),最少為3個(gè),每個(gè)連鎖群平均定位標(biāo)記數(shù)目為15.0個(gè)。并初步進(jìn)行了櫛孔扇貝主要生長(zhǎng)性狀的QT