櫛孔扇貝(Chlamys farreri)DNA斷裂與海水高滲透壓關(guān)系的探究.pdf

1、關(guān)于滲透壓對(duì)細(xì)胞DNA影響的研究在陸地生物中很少,海洋生物則更少,本研究領(lǐng)域?qū)儆趪?guó)際前沿。本文在櫛孔扇貝原代培養(yǎng)血淋巴細(xì)胞的基礎(chǔ)上,采用彗星實(shí)驗(yàn)和 TUNEL實(shí)驗(yàn)方法,從多角度雙向驗(yàn)證了海洋的高滲透壓(1200mOsm/L)會(huì)引起櫛孔扇貝DNA的斷裂,產(chǎn)生3’-OH末端。并且這種DNA斷裂是可逆的,當(dāng)外界環(huán)境的滲透壓下降到低滲透壓水平(460mOsm/L)時(shí),DNA斷裂又會(huì)自動(dòng)修復(fù)。
　　1.櫛孔扇貝血細(xì)胞的原代培養(yǎng)
　　首

2、先,實(shí)驗(yàn)材料是櫛孔扇貝的原代血淋巴細(xì)胞,采用的是1200mOsm/L的改進(jìn)L-15培養(yǎng)基,在20℃,pH=7.6下進(jìn)行培養(yǎng),。血淋巴細(xì)胞在1~3天內(nèi)已達(dá)到大量貼壁水平,培養(yǎng)3天內(nèi),血淋巴細(xì)胞細(xì)胞存活率高于90％。培養(yǎng)至10~15天,細(xì)胞逐漸死亡。培養(yǎng)3天以內(nèi)的櫛孔扇貝原代血淋巴細(xì)胞完全達(dá)到了進(jìn)行彗星實(shí)驗(yàn)以及TUNEL實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)。
　　2.彗星實(shí)驗(yàn)
　　彗星實(shí)驗(yàn)中,以櫛孔扇貝原代培養(yǎng)的血細(xì)胞為細(xì)胞材料,對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的H1299細(xì)

3、胞系為陰性對(duì)照,對(duì)原代血細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行了32h連續(xù)監(jiān)測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn),低滲透壓(460mOsm/L)細(xì)胞的Tail DNA%始終遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于高滲透壓(1200mOsm/L)中的細(xì)胞Tail DNA%,前者的Tail DNA%保持在6.04%到13.29%之間,后者的Tail DNA%自28.75%逐步升高至60.86%;交換滲透壓后,低、高滲透壓細(xì)胞的Tail DNA%情況也發(fā)生交換。因此證明:高滲透壓環(huán)境會(huì)導(dǎo)致櫛孔扇貝的血淋巴細(xì)胞DNA斷裂,

4、當(dāng)滲透壓降低時(shí),又會(huì)誘導(dǎo)DNA斷裂的修復(fù)。另外測(cè)量了扇貝個(gè)體的活體血淋巴細(xì)胞的Tail DNA%,結(jié)果發(fā)現(xiàn),活體血細(xì)胞的Tail DNA%在不斷變化,有時(shí)斷裂程度較低,Tail DNA%約在10%以下;有時(shí)斷裂程度較高,約在25%以上。
　　3.TUNEL實(shí)驗(yàn)
　　用TUNEL法對(duì)原代櫛孔扇貝血淋巴細(xì)胞進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn):在465-495nm波長(zhǎng)下,高滲透壓下培養(yǎng)的細(xì)胞有很強(qiáng)綠色熒光,DNA斷裂情況嚴(yán)重。低滲透壓下培養(yǎng)細(xì)胞