櫛孔扇貝(Chlamys farreri)DNA斷裂與海水高滲透壓關系的探究.pdf

1、關于滲透壓對細胞DNA影響的研究在陸地生物中很少,海洋生物則更少,本研究領域屬于國際前沿。本文在櫛孔扇貝原代培養(yǎng)血淋巴細胞的基礎上,采用彗星實驗和 TUNEL實驗方法,從多角度雙向驗證了海洋的高滲透壓(1200mOsm/L)會引起櫛孔扇貝DNA的斷裂,產生3’-OH末端。并且這種DNA斷裂是可逆的,當外界環(huán)境的滲透壓下降到低滲透壓水平(460mOsm/L)時,DNA斷裂又會自動修復。
　　1.櫛孔扇貝血細胞的原代培養(yǎng)
　　首

2、先,實驗材料是櫛孔扇貝的原代血淋巴細胞,采用的是1200mOsm/L的改進L-15培養(yǎng)基,在20℃,pH=7.6下進行培養(yǎng),。血淋巴細胞在1~3天內已達到大量貼壁水平,培養(yǎng)3天內,血淋巴細胞細胞存活率高于90％。培養(yǎng)至10~15天,細胞逐漸死亡。培養(yǎng)3天以內的櫛孔扇貝原代血淋巴細胞完全達到了進行彗星實驗以及TUNEL實驗的標準。
　　2.彗星實驗
　　彗星實驗中,以櫛孔扇貝原代培養(yǎng)的血細胞為細胞材料,對數期生長的H1299細

3、胞系為陰性對照,對原代血細胞培養(yǎng)物進行了32h連續(xù)監(jiān)測,結果發(fā)現,低滲透壓(460mOsm/L)細胞的Tail DNA%始終遠遠低于高滲透壓(1200mOsm/L)中的細胞Tail DNA%,前者的Tail DNA%保持在6.04%到13.29%之間,后者的Tail DNA%自28.75%逐步升高至60.86%;交換滲透壓后,低、高滲透壓細胞的Tail DNA%情況也發(fā)生交換。因此證明:高滲透壓環(huán)境會導致櫛孔扇貝的血淋巴細胞DNA斷裂,

4、當滲透壓降低時,又會誘導DNA斷裂的修復。另外測量了扇貝個體的活體血淋巴細胞的Tail DNA%,結果發(fā)現,活體血細胞的Tail DNA%在不斷變化,有時斷裂程度較低,Tail DNA%約在10%以下;有時斷裂程度較高,約在25%以上。
　　3.TUNEL實驗
　　用TUNEL法對原代櫛孔扇貝血淋巴細胞進行了體外實驗,發(fā)現:在465-495nm波長下,高滲透壓下培養(yǎng)的細胞有很強綠色熒光,DNA斷裂情況嚴重。低滲透壓下培養(yǎng)細胞