桃拉綜合征病毒單克隆抗體的制備及應(yīng)用.pdf

1、對(duì)蝦病毒性疾病的爆發(fā)流行能夠?qū)е螺^高的死亡率，其中桃拉綜合征病毒感染凡納濱對(duì)蝦（Penaeus vannamei）的累積死亡率達(dá)到40％～100％，給對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的損失，影響了對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的長(zhǎng)期健康穩(wěn)定的發(fā)展。目前檢測(cè)對(duì)蝦病毒性疾病的方法，仍然具有耗時(shí)長(zhǎng)、費(fèi)用高、實(shí)驗(yàn)室要求高等缺點(diǎn)，這需要建立起一種具有快速、便捷、敏感、結(jié)果判斷直觀的檢測(cè)方法。
　　 對(duì)蝦桃拉綜合征病毒（Taura syndrome virus, TSV）

2、能感染對(duì)蝦引起桃拉綜合征（Taura syndrome，TS）。病毒為單鏈正股RNA病毒，其核衣殼由三個(gè)主要結(jié)構(gòu)蛋白VP1，VP2和VP3（55，40和24kD）以及一個(gè)次要蛋白VP0(58 kD)構(gòu)成，其中VP1基因是其核衣殼上關(guān)鍵的抗原基因。
　　 本文主要根據(jù)對(duì)蝦桃拉綜合征病毒核衣殼蛋白VP1是主要的抗原蛋白，利用實(shí)驗(yàn)室所保存已構(gòu)建好的含有VP1保守區(qū)基因的菌株，大量誘導(dǎo)表達(dá)蛋白做為抗原蛋白，選取5～6周齡雌性Balb/c

3、小鼠，采用皮下免疫的方法免疫小鼠，免疫周期為7d，三次免疫后測(cè)得血清效價(jià)達(dá)到1∶10-4，加強(qiáng)免疫三天后，無(wú)菌條件下取小鼠脾細(xì)胞，在融合劑聚乙二醇的作用下與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)雜交，形成雜交瘤細(xì)胞，利用間接ELISA的方法，篩選出能夠分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞;雜交瘤細(xì)胞經(jīng)三次亞克隆后得到兩株穩(wěn)定分泌抗體的單克隆細(xì)胞株，將此細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，接種于9～10周齡Balb/c小鼠腹腔，注射量為1mL/只，每

4、只小鼠接種大約106個(gè)細(xì)胞，7～10d后抽取腹水，制備出效價(jià)達(dá)1∶10-6的單克隆抗體(McAb)，經(jīng)Western-Blotting驗(yàn)證其具有特異性。
　　 利用制備的單克隆抗體，以膜為固相載體制備對(duì)蝦桃拉綜合征病毒膠體金檢測(cè)試紙條，分別用20nm和30nm的膠體金標(biāo)記鼠抗pET32a-VP1cr單克隆抗體，選取最優(yōu)條件，從而建立起一種更快速，簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法。采用雙抗體夾心法，用20nm膠體金標(biāo)記鼠抗pET32a-VP1cr抗