農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大麥轉(zhuǎn)基因體系的優(yōu)化與β-葡聚糖酶基因過表達(dá)的研究.pdf

1、大麥?zhǔn)鞘澜缟纤拇蠹Z食作物之一。大麥轉(zhuǎn)基因體系是開展大麥基因功能研究和遺傳改良的重要手段。近年來大麥轉(zhuǎn)基因研究表明合適的外植體和轉(zhuǎn)基因方法是影響轉(zhuǎn)化效率的重要因素。因此，本研究分別選擇大麥未成熟胚和成熟胚為外植體，運(yùn)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法，對(duì)分化培養(yǎng)基中的激素種類與激素濃度進(jìn)行優(yōu)化。此外，對(duì)過表達(dá)β-葡聚糖酶基因的轉(zhuǎn)基因大麥進(jìn)行分子鑒定和一些品質(zhì)的測(cè)定。獲得的主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　 1.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大麥轉(zhuǎn)基因體系的優(yōu)化1.1大

2、麥未成熟胚分化培養(yǎng)基的改良。
　　 通過BAP(6-Benzylaminopurine)濃度梯度的再生效率比較試驗(yàn)，確定了再生培養(yǎng)基BCT(BarleyCallusTransition)中BAP的最適濃度:1mg/L。利用新的B13M培養(yǎng)基，它的主要成分是基礎(chǔ)培養(yǎng)基B1和1mg/L的BAP，用于誘導(dǎo)植株的再生，使誘導(dǎo)效率比原先使用的MS培養(yǎng)基提高了11倍。還比較兩種不同的生根培養(yǎng)基BGC(BarleyGlasstubeCultu

3、re)和BRM(BarleyRootingMedium)的生根效率，發(fā)現(xiàn)BRM的生根效率更高。
　　 1.2農(nóng)桿菌侵染材料的改進(jìn)。
　　 未成熟胚在農(nóng)桿菌侵染過程中容易發(fā)生農(nóng)桿菌的過量生長，造成幼胚的過早死亡。我們改用農(nóng)桿菌菌液直接侵染未成熟胚誘導(dǎo)的愈傷，將侵染后的愈傷組織經(jīng)篩選后進(jìn)行再生。這種方法不僅避免了幼胚的死亡，還提高了工作效率。
　　 1.3大麥成熟胚作為外植體的遺傳轉(zhuǎn)化研究我們初步建立了大麥成熟胚作為

4、外植體的遺傳轉(zhuǎn)化體系。獲得了15株再生植株。成熟胚作為外植體具有不會(huì)受到取材季節(jié)限制的優(yōu)點(diǎn)，但是愈傷的誘導(dǎo)效率顯著低于未成熟胚，有待于轉(zhuǎn)化體系的進(jìn)一步優(yōu)化。
　　 我們共進(jìn)行了6個(gè)外源基因表達(dá)載體的遺傳轉(zhuǎn)化，共得到48株陽性轉(zhuǎn)基因大麥苗，并移植于大田，有待于進(jìn)一步的鑒定和分析。
　　 2.過表達(dá)β-葡聚糖酶基因轉(zhuǎn)基因大麥的分子鑒定和品質(zhì)分析。
　　 大麥(1，3-1，4)-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.73)酶有

5、兩種不同基因編碼的同工酶，分別稱為β-葡聚糖酶EⅠ和β-葡聚糖酶EⅡ，由Glb2編碼的EⅡ僅在萌發(fā)籽粒的糊粉層中表達(dá)。實(shí)驗(yàn)室前期工作構(gòu)建35S:Glb2載體，并在大麥GoldenPromise中開展了過表達(dá)β-葡聚糖酶(EⅡ)的轉(zhuǎn)基因工作。我們對(duì)轉(zhuǎn)基因大麥進(jìn)行了分子鑒定。Southernblot結(jié)果顯示，EⅡ成功插入大麥基因組，其中一個(gè)株系DE3為單拷貝，其它為多拷貝。Semi-qRT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因大麥中Glb2的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)

6、高于野生型大麥。
　　 對(duì)35S:Glb2轉(zhuǎn)基因大麥的麥芽中β-葡聚糖酶的酶活進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因麥芽中β-葡聚糖酶的活性提高了72-105U/kg，顯著高于野生型麥芽。進(jìn)而又檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大麥籽粒中β-葡聚糖的含量，與和野生型大麥籽粒相比，這些籽粒中β-葡聚糖含量非常低，T2代籽粒中β-葡聚糖含量比野生型低了23-107倍，T3代籽粒中β-葡聚糖含量比野生型低了16-34倍。同時(shí)又檢測(cè)了大麥萌發(fā)過程中β-葡聚糖含量的變化，野

7、生型大麥在萌發(fā)后第三天β-葡聚糖含量下降，而轉(zhuǎn)基因大麥β-葡聚糖含量一直都處于很低的狀態(tài)。
　　 此外，我們檢測(cè)了千粒重，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因大麥千粒重比野生型高。而轉(zhuǎn)基因大麥籽粒中淀粉的含量，和野生型相比并沒有顯著的差別。我們推測(cè)轉(zhuǎn)基因大麥千粒重的增加可能是由于葡聚糖減少后，為了維持細(xì)胞壁的穩(wěn)定，纖維素合成增加，葡聚糖被分解成單糖和寡糖儲(chǔ)存起來造成的。
　　 總之，β-葡聚糖酶基因在大麥中的過量表達(dá)，能顯著降低籽粒中β-葡聚糖含