豬鏈球菌2型MRP和sspA抗原表位預(yù)測與表達(dá)及其免疫特性.pdf

1、本研究的目的在于獲得可抵御強(qiáng)毒豬鏈球菌2型(streptococcus suis type2，SS2)感染的保護(hù)性抗原肽，并分析其免疫特性，以期為研制低毒、高效的SS2蛋白亞單位疫苗提供科學(xué)依據(jù)。
　　 選取具有保護(hù)性或者具有重要免疫作用的蛋白——溶菌酶釋放蛋白(muramidase-released protein，MRP)和枯草桿菌素樣蛋白酶(subtilisin-like serineprotease，sspA)。參考NC

2、BI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中MRP、sspA氨基酸序列和結(jié)構(gòu)信息，避開蛋白的毒力結(jié)構(gòu)域、舍棄信號肽段、去除膜錨定結(jié)構(gòu)域和處于膜內(nèi)(胞漿)的肽段。運(yùn)用蛋白分析軟件ANTHEPROT5.0對蛋白的二級結(jié)構(gòu)(螺旋、折疊、轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲)和B細(xì)胞表位進(jìn)行綜合預(yù)測與分析(親水性、疏水性、抗原性、跨膜結(jié)構(gòu)、溶劑可及性等)，確定蛋白的B細(xì)胞優(yōu)勢表位簇。使用Oligo6.0和Primer5.0設(shè)計(jì)出兩端帶合適酶切位點(diǎn)的引物并通過PCR獲得預(yù)測的抗原肽段基因，酶切

3、連接插入原核表達(dá)載體pET32a，導(dǎo)入表達(dá)菌株BL21表達(dá)菌株，構(gòu)建重組抗原的原核表達(dá)系統(tǒng)。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，以滲透性休克法和熱休克法純化重組蛋白；使用滅活SS2免疫血清Western blot檢測重組蛋白的免疫原性及其與SS2免疫血清的反應(yīng)性。純化的重組蛋白免疫雌性SPF CD1小鼠檢測其安全性，用強(qiáng)毒SS2SDLVDU株攻毒重組蛋白免疫小鼠，評估重組蛋白的免疫保護(hù)效力。
　　 預(yù)測結(jié)果顯示MRP的950～1210aa肽段、s

4、spA的91～323aa肽段為B細(xì)胞優(yōu)勢表位簇。構(gòu)建了上述肽段基因與pET32a的原核重組表達(dá)系統(tǒng)，重組蛋白可溶性表達(dá)，微量蛋白測定儀測定表達(dá)量為10 mg/mL；Western blot顯示重組蛋白具有良好的免疫原性和反應(yīng)性；免疫安全性試驗(yàn)表明，MRP和sspA重組蛋白均安全可靠；免疫效力試驗(yàn)表明，MRP的950～1210aa肽段重組蛋白對小鼠的免疫保護(hù)率為40%，為菌體免疫所提供保護(hù)率的50%；sspA的91～323aa肽段重組蛋白