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文檔簡介
1、豬鏈球菌(Streptococcus suis,SS)是一種重要的人畜共患病病原,根據(jù)菌體莢膜多糖抗原性的不同,分為35個(gè)血清型(1-34型,l/2型)。世界范圍內(nèi)以SS2流行最廣,致病性最強(qiáng)。國內(nèi)1991年在廣東省首次分離鑒定到SS2,隨后于1998年和2005年分別在江蘇和四川部分地區(qū)暴發(fā)人感染SS2并致人死亡,危害嚴(yán)重。 歐美等國家對(duì)豬鏈球菌毒力因子的研究發(fā)現(xiàn)菌株有多種基因型,致病性最強(qiáng)的基因型為cps2/epf+/mrp+/sl
2、y+。而國內(nèi)SS2分離株的毒力因子分布情況不很清楚,本實(shí)驗(yàn)對(duì)國內(nèi)SS2分離株的毒力因子進(jìn)行檢測(cè)。并與國外菌株的毒力因子分布情況進(jìn)行比較,為建立檢測(cè)致病性SS2的多重PCR方法提供依據(jù)。選取豬鏈球菌7種主要毒力因子—谷氨酸脫氫酶(gdh)、莢膜多糖(cps)、溶菌酶釋放蛋白(mrp)、胞外因子(epf)、溶血素(sly)、纖連蛋白/血纖蛋白原結(jié)合蛋白(fpbs)和毒力相關(guān)基因orf2,設(shè)計(jì)與合成7對(duì)引物,用PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示:2
3、5株SS2國內(nèi)分離株,96%(24/25)表現(xiàn)為cps2/gdh+/epf/mrp+/sly+/fbps+/orf2+,僅l株表現(xiàn)為cps2/gdh+/epf-/mrp+/sly+/fbps+/orf2+。l株SS7國內(nèi)分離株為cps7/gdh+/epf-/mrp-/sly+/fbps-/orf2+;2株SS9國內(nèi)分離株均為cps9/gdh+/epf-/mrp-/sly-/fbps-/orf2+,可見國內(nèi)SS2分離株的基因型比較相似,毒
4、力基因分布特征有特點(diǎn),提示我國目前SS2的主要流行菌株是同時(shí)具有7種毒力因子的高致病菌株。 結(jié)合上述毒力因子分布情況,根據(jù)SS2的cps2J、mrp、orf2基因(virulent-associate sequence orf2)設(shè)計(jì)合成三對(duì)引物,建立三重PCR檢測(cè)方法,并對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序、酶切、特異性及敏感性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示:26株SS2致病菌株(25株國內(nèi)病豬分離株,l株德國標(biāo)準(zhǔn)參考株)均同時(shí)擴(kuò)增出這三個(gè)目的片段,5株其它血清
5、型豬鏈球菌(SSl,SS7,SS9)及13株非豬鏈球菌的其它豬源鏈球菌(蘭氏B群,C群和D群)均未擴(kuò)增出cps2J和mrp段,檢測(cè)結(jié)果與菌株的已知毒力因子背景完全相符。26株SS2的PCR擴(kuò)增片段經(jīng)酶切鑒定,與預(yù)期結(jié)果一致。以SS2四川株ZY05719為模板的三重PCR產(chǎn)物(cps2,mrp,orf2)測(cè)序結(jié)果與GenBank上相關(guān)序列比較,同源性分別為99%、100%、94%,測(cè)序結(jié)果登錄GenBank,登錄號(hào)分別是cps2J(DQ2
6、07606)、mrp(DQ207605)、orf2(DQ207938)。該P(yáng)CR敏感極限是600CFU。本試驗(yàn)所建立的三重PCR特異性強(qiáng)、敏感性好,可用于實(shí)驗(yàn)室豬鏈球菌2型的快速鑒定,有利于豬鏈球菌病的監(jiān)測(cè)與控制。為了進(jìn)一步快速確定豬鏈球菌2型致病菌株主要毒力因子,本試驗(yàn)根據(jù)GenBank發(fā)表的豬鏈球菌gdh、cps2d、mrp及epf殳計(jì)并合成四對(duì)引物,建立四重PCR檢測(cè)方法,并對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行特異性及敏感性實(shí)驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果:25/
7、26的SS2致病菌株可同時(shí)擴(kuò)增出四個(gè)目的片段,1株SS2致病菌株缺失epf基因;13株非豬鏈球菌的陰性對(duì)照株均未擴(kuò)出四個(gè)目的片段,上述檢測(cè)結(jié)果與菌株的已知毒力因子背景情況完全相符;敏感極限為500CFU。因此所建立的多重PCR特異性強(qiáng),敏感性好,適合實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),可輔助臨床診斷,有利于疾病的檢測(cè)與控制。 不同血清型的地區(qū)分布不同,除SS2外,SS9主要在德國、比利時(shí)、西班牙、荷蘭等地流行;芬蘭以SS7最為流行。為了解國內(nèi)是否存在除
8、SS2外的其他豬鏈球菌,本實(shí)驗(yàn)用建立的SSl、SS2、SS7、SS9的PCR方法,對(duì)送檢可疑菌株進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果結(jié)合其序列分析,確定其中一株為血清型7型,命名為SH040805;兩株為血清型9型,分別命名為SH040917、JX041226。進(jìn)一步用PCR方法對(duì)其毒力因子進(jìn)行檢測(cè),并進(jìn)行小鼠致病性實(shí)驗(yàn)及藥敏實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示SH040805表現(xiàn)型為cps7/gdh+/epf-/mrp-/sly+/fbps-/orf2+;SH040917及
9、JX041226表現(xiàn)型均為cps9/gdh+/epf-/mrp-/sly/fops-/orf2+。SS2(HA9801)的LD<,50>為2.23;SS7(SH040805)的LD<,50>為2.08;SS9(SH040917)對(duì)小鼠不致病。國內(nèi)豬鏈球菌分離株均呈多重耐藥;尤其SS9耐藥性最嚴(yán)重,對(duì)磺胺類藥物、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類藥物高度耐藥。綜上可知,我國的豬群除ss2外還存在SS7、SS9;其毒力因子分布與國外同種血清型
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