豬鏈球菌2型EF與MRP基因串聯(lián)表達及間接ELISA診斷方法的初步建立.pdf

1、豬鏈球菌2型是世界范圍內(nèi)引起豬鏈球菌病最主要的病原，是一種重要的人畜共患致病菌。本研究根據(jù)豬鏈球菌2型毒力因子EF和MRP的已知序列設計引物，通過PCR擴增出EF和MRP的基因片段，然后將擴增產(chǎn)物分別克隆入pMD18-T載體中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMD18-T-EF和pMD18-T-MRP。然后通過亞克隆方法分別從重組質(zhì)粒pMD18-T-EF和pMD18-T-MRP中擴增出包含EF蛋白和MRP蛋白主要抗原位點編碼區(qū)(EF:2236-2397

2、bp，MRP:1026-1181bp)的目的片段。接著，利用重組PCR技術(shù)將上述含有EF和MRP主要抗原位點的基因片段(2236bp-2397bp)和(1026bp-118 lbp)用linker連結(jié)起來構(gòu)成了一個含363bp重組片段。將該重組片段定向克隆到原核表達載體pET-32a中，構(gòu)建了pET-32a-EF-MRP的表達載體；經(jīng)過測序正確后，將重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)中；用lmmol/L IPTG誘導后pE

3、T-32a-EF-MRP出現(xiàn)32.5KD大小的目的融合蛋白，蛋白主要以包涵體形式存在，表達量占菌體總蛋白的30％左右。經(jīng)Western-blotting鑒定表明，融合蛋白能夠被豬鏈球菌2型陽性血清所識別。用Ni2+親和層析柱對融合蛋白進行純化，獲得3.58 mg/L的His-EF-MRP目的蛋白。利用純化的重組蛋白His-EF-MRP作為包被抗原，建立了檢測鍺鏈球菌2型抗體的間接ELISA方法，并且對間接ELISA方法反應參數(shù)和反應條件

4、進行摸索。結(jié)果表明重組蛋白抗原的最適包被濃度為0.5ug/mL;最適包被條件是37℃過夜，以1％BSA作為封閉液；二抗HRP-羊抗豬IgG最佳工作濃度為1:2000;高免血清最大稀釋度為1：400;待檢血清的最佳稀釋度為1:40;底物最適作用時間為37℃作用15 min:陰陽性臨界值為0.36。特異性試驗表明，建立的間接ELISA方法不均與其他細菌和病毒的陽性血清發(fā)生交叉反應。敏感性試驗表明，間接ELISA方法比AGID檢測敏感32-1