運輸對夏南牛外周血淋巴細胞HSPs基因表達的影響及HSP70基因的克隆.pdf

1、應激是機體受到應激性刺激后所產(chǎn)生的一種非特異性反應，畜禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展以及國內(nèi)外畜禽貿(mào)易的繁榮，畜禽運輸成為畜牧業(yè)中的必要環(huán)節(jié)。本試驗隨機選擇相同環(huán)境中飼養(yǎng)的6頭夏南牛(♂)，用牛用動物運輸車進行運輸應激，運輸時間為運輸前1h、運輸前0h；運輸2h、3h、9h、10h、15h、20h；運輸后10h、20h、30h。道路包括城市道路、國道、高速的混合路，速度控制在60-70km/h，整個運輸過程沒有飲水和喂食。對試驗肉牛進行及時采取血液，分

2、離血清、血漿、淋巴細胞，分離的血清和血漿予-20℃保存，分別用于皮質(zhì)醇(Cor)和促腎上激素(ACTH)的檢測，分離淋巴細胞于-80℃保存，通過RT-PCR克隆了肉牛外周血淋巴細胞中受運輸脅迫誘導基因，用于熱應激蛋白(HsP8)酶聯(lián)免疫反應檢涮和對應mRNA在不同運輸時間階段的表達特性。從而探討肉牛在長途運輸過程中熱應激蛋白(HSPs)表達及其對應的mRNA轉(zhuǎn)錄規(guī)律，及其它們之間的相關性。
　　 利用RT-PCR方法克隆了1個肉

3、牛運輸脅迫誘導基因；HSP70，其基因克隆片段長度為985bp。BLASTX搜索結(jié)果顯示，克隆基因編碼的核苷酸序列與多個動物中的熱激蛋白HSP70同源性很高，其中與牛的AY662497.1、綿羊的EF197836.1和野豬的NM_213766.1序列同源性分別高達99％、99％和97％。
　　 利用放射免疫法對激素水平進行分析，研究長途運輸應激對肉牛激素水平的影響。結(jié)果表明，試驗牛血清皮質(zhì)醇(Cor)在運輸前較低，在運輸10h、

4、15h和20h極顯著增加(P<0.01)，運輸?shù)竭_后慢慢恢復到正常水平。在運輸前試驗牛血漿中促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)較低，運輸3h時極顯著升高(P<0.01)，這種升高趨勢持續(xù)到運后20h，運達后30小時恢復正常水平。
　　 實時熒光定量法探討了運輸應激牛淋巴細胞中HSPsmRNA轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果證明，試驗牛的外周血淋巴細胞的HSP70mRNA的轉(zhuǎn)錄水平在運輸3h、9h顯著增加(P<0.05)，隨后表達恢復到運輸前水平；HSP

5、27mRNA轉(zhuǎn)錄水平在運輸3h顯著升高(P<0.05)；HSP90mRNA轉(zhuǎn)錄水平僅在運后10h開始升高，并在運后20h極顯著升高(P<0.01)，達到最大值。商業(yè)化試劑盒ELISA測定運輸應激肉牛外周血淋巴細胞中的HSP70、HSP27和HSP90的水平。通過標準曲線法完成樣品定量，用β-actin控制蛋白提取過程中出現(xiàn)的誤差。結(jié)果顯示，試驗牛的外周血淋巴細胞的HSP70在運輸2h、3h、9h的表達極顯著增加(P<0.01)，隨后表達