運輸對夏南牛外周血淋巴細(xì)胞HSPs基因表達(dá)的影響及HSP70基因的克隆.pdf

1、應(yīng)激是機體受到應(yīng)激性刺激后所產(chǎn)生的一種非特異性反應(yīng)，畜禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展以及國內(nèi)外畜禽貿(mào)易的繁榮，畜禽運輸成為畜牧業(yè)中的必要環(huán)節(jié)。本試驗隨機選擇相同環(huán)境中飼養(yǎng)的6頭夏南牛(♂)，用牛用動物運輸車進(jìn)行運輸應(yīng)激，運輸時間為運輸前1h、運輸前0h；運輸2h、3h、9h、10h、15h、20h；運輸后10h、20h、30h。道路包括城市道路、國道、高速的混合路，速度控制在60-70km/h，整個運輸過程沒有飲水和喂食。對試驗肉牛進(jìn)行及時采取血液，分

2、離血清、血漿、淋巴細(xì)胞，分離的血清和血漿予-20℃保存，分別用于皮質(zhì)醇(Cor)和促腎上激素(ACTH)的檢測，分離淋巴細(xì)胞于-80℃保存，通過RT-PCR克隆了肉牛外周血淋巴細(xì)胞中受運輸脅迫誘導(dǎo)基因，用于熱應(yīng)激蛋白(HsP8)酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢涮和對應(yīng)mRNA在不同運輸時間階段的表達(dá)特性。從而探討肉牛在長途運輸過程中熱應(yīng)激蛋白(HSPs)表達(dá)及其對應(yīng)的mRNA轉(zhuǎn)錄規(guī)律，及其它們之間的相關(guān)性。
　　 利用RT-PCR方法克隆了1個肉

3、牛運輸脅迫誘導(dǎo)基因；HSP70，其基因克隆片段長度為985bp。BLASTX搜索結(jié)果顯示，克隆基因編碼的核苷酸序列與多個動物中的熱激蛋白HSP70同源性很高，其中與牛的AY662497.1、綿羊的EF197836.1和野豬的NM_213766.1序列同源性分別高達(dá)99％、99％和97％。
　　 利用放射免疫法對激素水平進(jìn)行分析，研究長途運輸應(yīng)激對肉牛激素水平的影響。結(jié)果表明，試驗牛血清皮質(zhì)醇(Cor)在運輸前較低，在運輸10h、

4、15h和20h極顯著增加(P<0.01)，運輸?shù)竭_(dá)后慢慢恢復(fù)到正常水平。在運輸前試驗牛血漿中促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)較低，運輸3h時極顯著升高(P<0.01)，這種升高趨勢持續(xù)到運后20h，運達(dá)后30小時恢復(fù)正常水平。
　　 實時熒光定量法探討了運輸應(yīng)激牛淋巴細(xì)胞中HSPsmRNA轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果證明，試驗牛的外周血淋巴細(xì)胞的HSP70mRNA的轉(zhuǎn)錄水平在運輸3h、9h顯著增加(P<0.05)，隨后表達(dá)恢復(fù)到運輸前水平；HSP

5、27mRNA轉(zhuǎn)錄水平在運輸3h顯著升高(P<0.05)；HSP90mRNA轉(zhuǎn)錄水平僅在運后10h開始升高，并在運后20h極顯著升高(P<0.01)，達(dá)到最大值。商業(yè)化試劑盒ELISA測定運輸應(yīng)激肉牛外周血淋巴細(xì)胞中的HSP70、HSP27和HSP90的水平。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法完成樣品定量，用β-actin控制蛋白提取過程中出現(xiàn)的誤差。結(jié)果顯示，試驗牛的外周血淋巴細(xì)胞的HSP70在運輸2h、3h、9h的表達(dá)極顯著增加(P<0.01)，隨后表達(dá)