布魯氏菌外膜蛋白Omp39和Omp14的原核表達(dá)及其免疫原性鑒定.pdf

1、布魯氏菌病(Brucellosis)是由細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性布魯氏菌引起的一種人畜共患病。臨床上以發(fā)熱，流產(chǎn)為主要癥狀，嚴(yán)重威脅著人畜健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)表明，全世界每年出現(xiàn)50萬(wàn)例人布魯氏菌病，每年因布魯氏菌病造成的經(jīng)濟(jì)損失近30億美元。 在布魯氏菌病控制過(guò)程中，檢疫淘汰是一項(xiàng)重要措施。檢疫淘汰的前提就是準(zhǔn)確的診斷，但目前常用的布魯氏菌病血清學(xué)診斷方法不能區(qū)分是疫苗免疫還是自然感染后引起的血清學(xué)反應(yīng)。尋找合適的布魯氏菌診

2、斷性抗原和研制具有標(biāo)記性的疫苗一直是人們追求的目標(biāo)。 布魯氏菌外膜蛋白位于細(xì)菌細(xì)胞膜的最外層，因其具有免疫原性和免疫保護(hù)作用一直備受注目。本試驗(yàn)從GenBank中下載編碼布魯氏菌外膜蛋白的基因，用BLAST分析后選取與布魯氏菌豬、牛、羊這三種生物型基因序列的同源性高又與其他革蘭氏陰性細(xì)菌沒(méi)有交叉反應(yīng)的基因；同時(shí)對(duì)目的基因編碼的蛋白用TMHMM和ConPredⅡ軟件進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)和親水性的分析后，選取沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)且親水性較好的蛋白進(jìn)

3、行研究。本試驗(yàn)依據(jù)以上條件選取了羊布魯氏菌16M的外膜蛋白Omp39和Ompl4進(jìn)行初步研究。 通過(guò)Premier 5.0設(shè)計(jì)引物用于擴(kuò)增選定的兩個(gè)目的基因，以滅活的16M布魯氏茵基因組為模板用降落PCR擴(kuò)增目的片段。將限制性內(nèi)切酶BamHI、EcoRI雙酶切的目的片段直接與同樣雙酶切的表達(dá)載體pGEX-4T-2連接，之后將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL2l。提取的重組質(zhì)粒經(jīng)菌液PCR鑒定、重組載體雙酶切鑒定和測(cè)序分析確定目的基

4、因成功插入到了表達(dá)載體中。然后將含有重組表達(dá)載體的菌株在不同溫度、不同時(shí)間、不同IPTG濃度下誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果顯示目的蛋白在大腸桿菌中獲得了大量表達(dá)。表達(dá)蛋白通過(guò)Western-blotting分析發(fā)現(xiàn)能夠與布魯氏菌病豚鼠陽(yáng)性動(dòng)物血清發(fā)生較強(qiáng)烈的反應(yīng)。之后用電洗脫的方法純化了目的蛋白，并將其作為包被抗原，用牛布魯氏菌陽(yáng)性血清為一抗，兔抗牛IgG為二抗優(yōu)化ELISA檢測(cè)條件，試圖進(jìn)一步探索目的蛋白作為診斷性蛋