冬小麥抗寒相關(guān)4種miRNAs的克隆及表達(dá)特征分析.pdf

1、小麥作為重要的糧食作物之一，其產(chǎn)量備受關(guān)注。在東北嚴(yán)寒地區(qū)低溫是影響小麥產(chǎn)量的重要因素之一，‘東農(nóng)冬麥1號(hào)’強(qiáng)抗寒（可耐-30℃低溫）冬小麥栽培品種是我國首例可在黑龍江省高寒地區(qū)安全越冬（返青率大于80％）的冬小麥品種。
　　MicroRNA(miRNA)是重要的調(diào)控因子，在基因的轉(zhuǎn)錄后負(fù)調(diào)控其靶基因，對(duì)mRNA表達(dá)及表達(dá)后翻譯起到阻滯作用。研究表明miRNA在植物抗逆過程、生長(zhǎng)發(fā)育、免疫反應(yīng)、激素調(diào)節(jié)等方面可起到重要的調(diào)控作用。

2、miRNA在擬南芥和其他模式生物中已被廣泛研究，而冬小麥中響應(yīng)低溫的miRNA研究較滯后，且miRNA在冬小麥過表達(dá)的遺傳轉(zhuǎn)化研究抗寒性也鮮有報(bào)道。本研究以‘東農(nóng)冬麥1號(hào)’為實(shí)驗(yàn)材料，以實(shí)驗(yàn)室前期建立的冬小麥microRNA數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，篩選出在低溫脅迫下表達(dá)量變化顯著的4種miRNA，克隆4種miRNA的前體并構(gòu)建植物融合過表達(dá)載體，以實(shí)驗(yàn)室前期研究的成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化體系為基礎(chǔ)，篩選轉(zhuǎn)基因植株適宜抗生素濃度，將外源tae-pre-miR

3、156在冬小麥成熟胚愈傷組織中過表達(dá)，篩選再生植株;在大田自然降溫至5℃、-10℃、-25℃時(shí)取分蘗節(jié)驗(yàn)證miRNA與之靶基因在低溫脅迫下的表達(dá)模式。由于小麥遺傳背景復(fù)雜，轉(zhuǎn)化效率低，很難獲得大量的再生植株，因此，同時(shí)檢測(cè)擬南芥中4種miRNA成熟體與其靶基因在低溫脅迫下的關(guān)系。研究結(jié)果如下:
　　(1)采用3種靶基因預(yù)測(cè)軟件，通過生物信息學(xué)分析篩選出所預(yù)測(cè)的miR156、miR160、miR398和miR444b的靶基因分別是S

4、PL3、CSD1、ARF和MADS-box。
　　(2)克隆獲得冬小麥這4種miRNA的前體，并構(gòu)建其植物過表達(dá)載體Pcambia3300Su-miRNA，將4種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，得到T1代種子。
　　(3)利用實(shí)驗(yàn)室前期建立的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的‘東農(nóng)冬麥1號(hào)’遺傳轉(zhuǎn)化體系，向成熟胚愈傷組織轉(zhuǎn)化外源tae-miR156前體，經(jīng)抗性篩選，獲得小麥再生植株，提取轉(zhuǎn)基因小麥的基因組DNA，PCR檢測(cè)為陽性，初步表明外源tae

5、-miR156整合到小麥的染色體上。
　　(4)大田自然降溫條件下，分別于5℃、-10℃、-25℃時(shí)取分蘗節(jié)，通過熒光定量PCR分析miRNAs及其靶基因表達(dá)量，進(jìn)而分析4種miRNA應(yīng)答低溫的表達(dá)模式，結(jié)果顯示:miR156、miR160和miR444b表達(dá)量隨低溫脅迫呈先降后升的趨勢(shì)，而miR398在三個(gè)溫度點(diǎn)呈現(xiàn)梯度下調(diào)，其miRNAs靶基因表達(dá)模式與miRNAs的變化呈負(fù)相關(guān)，表明這4種miRNA在冬小麥遭遇低溫脅迫時(shí)發(fā)揮

6、作用。當(dāng)溫度達(dá)到-10℃時(shí)，除miR398外，其余3種miRNAs的表達(dá)量均達(dá)到最低值，且-25℃時(shí)表達(dá)量明顯增加;相應(yīng)的靶基因則呈現(xiàn)負(fù)調(diào)控。表明這4種miRNA能夠應(yīng)答低溫脅迫。
　　(5)對(duì)野生型擬南芥置于4℃低溫處理，并在不同時(shí)間點(diǎn)取葉片，0h為對(duì)照組。檢測(cè)擬南芥葉片中4種miRNA及其靶基因在低溫脅迫的表達(dá)，結(jié)果顯示:4℃處理0～72h時(shí)，miR156和miR160的變化基本呈現(xiàn)為先升再降再上升，整體呈上升表達(dá)的趨勢(shì)，但m