褶紋冠蚌防御素基因表達(dá)及蛋白活性分析.pdf

1、本論文從褶紋冠蚌中克隆到了防御素基因的 cDNA全長序列,并對其同源性和三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析,采用定量 PCR方法分析了其組織表達(dá)情況及對革蘭氏陰性菌大腸桿菌和革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌的抑菌效應(yīng)。其次,以質(zhì)粒pGex-4T-1為載體,將防御素基因在大腸桿菌中進(jìn)行了原核表達(dá)及純化,獲得了純度較高的重組蛋白,并通過微孔液體培養(yǎng)法和平皿抑菌圈法對重組防御素蛋白的抑菌活性進(jìn)行了檢測。最后,利用激光共聚焦掃描顯微鏡和環(huán)境掃描電鏡對防御素的抑菌機(jī)理

2、進(jìn)行了初探。
　　褶紋冠蚌防御素基因的 cDNA全長序列為514 bp,其中5’ UTR有57 bp;3’ UTR有242 bp,含有一個(gè) poly(A)尾;開放閱讀框(Open Reading Frame,ORF)長度為192 bp,編碼63個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。經(jīng) SignalP3.0軟件分析,該蛋白 N端為1個(gè)由23個(gè)氨基酸構(gòu)成的信號肽 MRVAVVLALVLLLAVIDIPQAAA,成熟肽由40個(gè)氨基酸組成。該蛋白理論等電

3、點(diǎn)為8.72,分子量為7.13 kD。三級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示其由一個(gè)α螺旋和兩個(gè)β折疊片組成,形成典型的 CSαβ結(jié)構(gòu)。
　　利用半定量 PCR檢測了防御素基因在褶紋冠蚌不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明褶紋冠蚌防御素基因在血液、外套膜、鰓和肝胰腺各組織中均有表達(dá)。其中,血液與鰓組織的表達(dá)量相當(dāng),外套膜組織的表達(dá)量最高,約為血液和鰓的表達(dá)量1.25倍,肝胰腺的表達(dá)量次之。
　　經(jīng)嗜水氣單胞菌(109 cell/mL)刺激后,血液中的防

4、御素基因表達(dá)量呈現(xiàn)先上升而后逐漸下降的趨勢,在12 h時(shí)達(dá)到峰值;外套膜組織中防御素基因表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢,而后逐漸趨于穩(wěn)定;鰓組織中防御素基因的表達(dá)水平無顯著變化;肝胰腺中防御素基因的表達(dá)量呈現(xiàn)持續(xù)的下降趨勢。
　　經(jīng)金黃色葡萄球菌刺激后,血液中防御素基因表達(dá)量在24 h時(shí)達(dá)到峰值,到48 h時(shí)降至最低。外套膜組織中防御素基因表達(dá)量在12 h時(shí)達(dá)到一個(gè)極低值,而后又在24 h時(shí)達(dá)到峰值。鰓中防御素基因的表達(dá)量在12 h時(shí)達(dá)到最大

5、值。肝胰腺中防御素基因的表達(dá)量同樣的在12 h時(shí)略有下降,而后在24 h時(shí)達(dá)到峰值。肌肉中防御素的表達(dá)在12 h時(shí)有所下降,而后在24 h時(shí)達(dá)到峰值,在48 h時(shí)又降至最低。
　　經(jīng) IPTG誘導(dǎo)后成功表達(dá)了重組蛋白,上清液中存在可溶性蛋白。純化出上清蛋白,測得了濃度為0.22 mg/mL。
　　檢測不同濃度重組防御素蛋白的抑菌活性,發(fā)現(xiàn)其對大腸桿菌、鰻弧菌、嗜水氣單胞菌和金黃色葡萄球菌均具有不同程度的抑菌活性,且0.2mg