褶紋冠蚌防御素基因表達(dá)及蛋白活性分析.pdf

1、本論文從褶紋冠蚌中克隆到了防御素基因的 cDNA全長(zhǎng)序列,并對(duì)其同源性和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析,采用定量 PCR方法分析了其組織表達(dá)情況及對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌和革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌的抑菌效應(yīng)。其次,以質(zhì)粒pGex-4T-1為載體,將防御素基因在大腸桿菌中進(jìn)行了原核表達(dá)及純化,獲得了純度較高的重組蛋白,并通過(guò)微孔液體培養(yǎng)法和平皿抑菌圈法對(duì)重組防御素蛋白的抑菌活性進(jìn)行了檢測(cè)。最后,利用激光共聚焦掃描顯微鏡和環(huán)境掃描電鏡對(duì)防御素的抑菌機(jī)理

2、進(jìn)行了初探。
　　褶紋冠蚌防御素基因的 cDNA全長(zhǎng)序列為514 bp,其中5’ UTR有57 bp;3’ UTR有242 bp,含有一個(gè) poly(A)尾;開(kāi)放閱讀框(Open Reading Frame,ORF)長(zhǎng)度為192 bp,編碼63個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。經(jīng) SignalP3.0軟件分析,該蛋白 N端為1個(gè)由23個(gè)氨基酸構(gòu)成的信號(hào)肽 MRVAVVLALVLLLAVIDIPQAAA,成熟肽由40個(gè)氨基酸組成。該蛋白理論等電

3、點(diǎn)為8.72,分子量為7.13 kD。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示其由一個(gè)α螺旋和兩個(gè)β折疊片組成,形成典型的 CSαβ結(jié)構(gòu)。
　　利用半定量 PCR檢測(cè)了防御素基因在褶紋冠蚌不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明褶紋冠蚌防御素基因在血液、外套膜、鰓和肝胰腺各組織中均有表達(dá)。其中,血液與鰓組織的表達(dá)量相當(dāng),外套膜組織的表達(dá)量最高,約為血液和鰓的表達(dá)量1.25倍,肝胰腺的表達(dá)量次之。
　　經(jīng)嗜水氣單胞菌(109 cell/mL)刺激后,血液中的防

4、御素基因表達(dá)量呈現(xiàn)先上升而后逐漸下降的趨勢(shì),在12 h時(shí)達(dá)到峰值;外套膜組織中防御素基因表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì),而后逐漸趨于穩(wěn)定;鰓組織中防御素基因的表達(dá)水平無(wú)顯著變化;肝胰腺中防御素基因的表達(dá)量呈現(xiàn)持續(xù)的下降趨勢(shì)。
　　經(jīng)金黃色葡萄球菌刺激后,血液中防御素基因表達(dá)量在24 h時(shí)達(dá)到峰值,到48 h時(shí)降至最低。外套膜組織中防御素基因表達(dá)量在12 h時(shí)達(dá)到一個(gè)極低值,而后又在24 h時(shí)達(dá)到峰值。鰓中防御素基因的表達(dá)量在12 h時(shí)達(dá)到最大

5、值。肝胰腺中防御素基因的表達(dá)量同樣的在12 h時(shí)略有下降,而后在24 h時(shí)達(dá)到峰值。肌肉中防御素的表達(dá)在12 h時(shí)有所下降,而后在24 h時(shí)達(dá)到峰值,在48 h時(shí)又降至最低。
　　經(jīng) IPTG誘導(dǎo)后成功表達(dá)了重組蛋白,上清液中存在可溶性蛋白。純化出上清蛋白,測(cè)得了濃度為0.22 mg/mL。
　　檢測(cè)不同濃度重組防御素蛋白的抑菌活性,發(fā)現(xiàn)其對(duì)大腸桿菌、鰻弧菌、嗜水氣單胞菌和金黃色葡萄球菌均具有不同程度的抑菌活性,且0.2mg