半夏蛋白的提取分離、含量測(cè)定及對(duì)Hela細(xì)胞的作用研究.pdf

1、半夏(Pinellia ternata(Thunb.)Breit.)為天南星科半夏屬植物,是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材,具有燥濕化痰,降逆止嘔,消痞散結(jié)的功效。主要活性成分有甾醇、生物堿、活性多糖、氨基酸、有機(jī)酸和凝集素等。其中,半夏凝集素是半夏總蛋白的主要成分之一。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),半夏蛋白具有多種生物活性,是半夏抗蟲(chóng)、抗腫瘤及抗生育的主要有效成分,成為半夏研究的熱點(diǎn)。本文的研究?jī)?nèi)容是半夏總蛋白及半夏凝集素,主要包括半夏總蛋白的動(dòng)態(tài)變化及半夏凝

2、集素對(duì)Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)的影響。
　　 本研究采用4種常用的總蛋白質(zhì)提取方法(丙酮沉淀法、95％(NH4)2SO4鹽析法、TCA-丙酮法和Tris-飽和酚法),同等條件下分別提取半夏總蛋白質(zhì),對(duì)其進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳,電泳結(jié)果顯示:四種方法提取的總蛋白電泳行為無(wú)明顯差異。采用Bradford蛋白含量測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白含量,四種方法提取的總蛋白含量結(jié)果為:TCA-丙酮法(1.082 mg/m

3、l)＞95％(NH4)2SO4鹽析法(0.678 mg/ml)＞Tris-飽和酚法(0.493 mg/ml)＞丙酮法(0.369 mg/ml),比較分析發(fā)現(xiàn)TCA-丙酮法提取半夏總蛋白效果最佳。
　　 利用TCA-丙酮法分別提取半夏不同生長(zhǎng)時(shí)期(出芽期、全苗期、珠芽期、佛焰苞期及倒苗期)采集到的樣品總蛋白質(zhì),SDS-PAGE電泳檢測(cè)及Bradford蛋白含量測(cè)定試劑盒測(cè)定半夏不同生長(zhǎng)時(shí)期總蛋白質(zhì)含量。其中,不同時(shí)期采集到的樣品分

4、為新鮮和干燥處理兩組。SDS-PAGE電泳結(jié)果比較分析發(fā)現(xiàn):新鮮組樣品中,不同生長(zhǎng)時(shí)期的總蛋白成分有差異;新鮮組樣品多干燥處理組樣品10條蛋白帶,且干燥處理組樣品中出現(xiàn)了新鮮組樣品中沒(méi)有的蛋白條帶(如表觀分子量為26 kDa和35 kDa的蛋白),而表觀分子量為12 kDa和24 kDa的蛋白成分在兩個(gè)處理及各個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期中占的比例均較大。含量測(cè)定結(jié)果為:新鮮半夏不同生長(zhǎng)時(shí)期中,塊莖中總蛋白含量變化表現(xiàn)為倒苗期＞佛焰苞期＞出芽期＞珠芽期＞

5、全苗期;不同生長(zhǎng)時(shí)期干燥處理半夏中,塊莖中總蛋白含量變化表現(xiàn)為倒苗期＞珠芽期＞出芽期＞佛焰苞期＞全苗期。含量測(cè)定結(jié)果顯示倒苗期總蛋白含量最高,全苗期總蛋白含量最低。結(jié)果表明,半夏不同生長(zhǎng)時(shí)期總蛋白成分發(fā)生了一定變化,同一蛋白成分在不同的生長(zhǎng)時(shí)期含量有差異,新鮮和干燥處理樣品中蛋白含量和種類也有一定差異。
　　 同時(shí),本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)半夏凝集素的甘露糖專一結(jié)合的性質(zhì),設(shè)計(jì)制備了甘露糖-Sepharose4B凝膠,從半夏總蛋白中成功分離

6、純化出一種半夏凝集素,SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè),表觀分子量為12 kDa,純度達(dá)到電泳純,研究表明該凝集素是一種糖蛋白,能凝集小鼠紅細(xì)胞。
　　 用不同濃度(0.004 mg/mL、0.02 mg/mL、0.1 mg/mL、0.5 mg/mL和1 mg/mL)半夏凝集素處理Hela細(xì)胞,用MTT法測(cè)定細(xì)胞活力,結(jié)果表明低濃度(0.004 mg/mL、0.02 mg/mL及0.1 mg/mL)具有促進(jìn)Hela細(xì)胞增殖的作用,且

7、隨濃度和時(shí)間增加促增殖作用減弱,48 h時(shí)有最大促增殖效率為23.36％;高濃度(0.5 mg/mL、1 mg/mL)有抑制Hela細(xì)胞增殖的作用,并且這種作用有時(shí)間和劑量依賴性,72 h時(shí)有最大抑制率為71.89％。
　　 同時(shí),選取對(duì)細(xì)胞有促增殖和抑制作用的兩個(gè)濃度0.004 mg/mL和1 mg/mL,作用于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的Hela細(xì)胞,PBS作為對(duì)照,分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h。倒置顯微鏡下觀察攝影,結(jié)果顯示:濃度