王漿主蛋白MRJP-1分離測(cè)定及對(duì)細(xì)胞的促生長(zhǎng)作用研究.pdf

1、蜂王漿是蜂群中5-15日齡期哺育工蜂咽下腺、上顎腺和腦后腺等腺體的分泌物，它調(diào)控著蜜蜂生長(zhǎng)發(fā)育過程中的級(jí)型分化，并對(duì)人體具有營(yíng)養(yǎng)保健功能。近年來，蜂王漿蛋白和多肽成為科學(xué)家們關(guān)注的熱點(diǎn)，其中王漿主蛋白1(MRJP-1)是蜜蜂級(jí)型分化關(guān)鍵因子的最新發(fā)現(xiàn)，使王漿主蛋白(MRJPs)和MRJP-1的研究成為研究熱點(diǎn)。本文研究MRJPs、MRJP-1的提取、營(yíng)養(yǎng)功能和應(yīng)用前景。
　　 主要研究結(jié)果如下：
　　 1)MRJPs、M

2、RJP-1的提取分離用離心透析方法制備MRJPs凍干粉。取鮮王漿溶液，經(jīng)抽提、離心、取上清、凍干，得到MRJPs粗蛋白凍干粉，其蛋白得率為鮮王漿的7.34％。經(jīng)SDS-PAGE分析，MRJPs含4條蛋白條帶，由文獻(xiàn)推測(cè)為：77-87kDa MRJP-5、60-70kDa MRJP-3、57kDa MRJP-1和49kDa MRJP-2。
　　 用超速離心法分離制備MRJP-1。將鮮王漿稀釋，超速離心兩次、取膠狀沉淀，即為MRJP

3、-1，其得率約為鮮王漿的3.21%。SDS-PAGE電泳分析表明，部分MRJP-1仍殘留于王漿上清液中，分離得到的MRJP-1為單一蛋白質(zhì)，分子量約57kDa。
　　 2)MRJP-1特異性多克隆抗體制備用化學(xué)合成多肽制備MRJP-1特異性多克隆抗體。首先，采用生物信息軟件，對(duì)MRJPs家族(MRJP-1-MRJP-9)作氨基酸序列同源性分析，從MRJP-1氨基酸全序列中篩選出其不同于該家族其他成員(MRJP-2-MRJP-9)

4、的特異性序列，用化學(xué)法合成該多肽；然后用合成多肽免疫兔子，取兔血清，經(jīng)過用親和層析法純化，得到特異性多克隆抗體(R2)。
　　 Western blot結(jié)果顯示，MRJP-1抗體R2能專一性地識(shí)別蜂王漿主蛋白MRJP-1。經(jīng)Elisa測(cè)定，其效價(jià)大于1:20000。而用重組大腸桿菌表達(dá)的MRJP-1全序列蛋白制備的抗體(R1)，只能特異性地識(shí)別MRJPs家族蛋白，而不能專一性地識(shí)別MRJP-1，其Elisa效價(jià)大于1:10000

5、，活性只有為前者的1/2。
　　 3)蜂王漿中MRJP-1含量的Elisa法測(cè)定用Elisa法測(cè)定蜂王漿中MRJP-1含量。以MRJP-1特異性抗體R2為一抗，以超速離心法制備的MRJP-1為標(biāo)準(zhǔn)蛋白(抗原)作倍比稀釋，采用Elisa法檢測(cè)不同濃度MRJP-1蛋白樣品的吸光度450nm-630nm，建立吸光度與MRJP-1蛋白濃度間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將MRJPs凍干粉稀釋，作為抗原，同樣條件下測(cè)定獲得樣品吸光度，代入所建標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果

6、顯示新蜂王漿含MRJP-13.85%。而Rl作為一抗可與所有MRJPs家族成員發(fā)生交叉反應(yīng)，不具備特異性，只能用于MRJPs的定量測(cè)定，因此Elisa法測(cè)定得到的結(jié)果顯著高于R2為一抗的測(cè)定結(jié)果。
　　 該方法操作簡(jiǎn)單，方便迅速，成本低廉，可用于測(cè)定顯示蜂王漿質(zhì)量的標(biāo)志性蛋白MRJP-1，作為判斷蜂王漿質(zhì)量的主要依據(jù)。
　　 4)MRJPs、MRJP-1對(duì)細(xì)胞的促生長(zhǎng)作用研究通過MRJPs、MRJP-1替代牛血清培養(yǎng)細(xì)胞

7、實(shí)驗(yàn)，觀察MRJPs、MRJP-1對(duì)spc-A-1、sw480、sw620、293T、Hepli4、HCT-116和A2780等7個(gè)細(xì)胞株形態(tài)和生長(zhǎng)、分裂的影響。結(jié)果顯示：①M(fèi)RJPs、MRJP-1能部分代替FBS用于細(xì)胞培養(yǎng)，但活性低于FBS。兩者對(duì)spc-A-1、sw480、sw620、293T、Hepli4細(xì)胞均有一定的促進(jìn)生長(zhǎng)和分裂活性，能不同程度地促進(jìn)部分細(xì)胞生長(zhǎng)分裂、維持細(xì)胞正常形態(tài)。②MRJPs、MRJP-1對(duì)細(xì)胞的促生長(zhǎng)