萊氏野村菌(Nomuraea rileyi)的固體發(fā)酵及分生孢子活力的研究.pdf

1、萊氏野村菌(Nomuraea rileyi)是一種重要的昆蟲病原真菌，能感染30多種鱗翅目昆蟲，尤其對(duì)夜蛾科害蟲的致病力很強(qiáng)，且常能引起病害流行，對(duì)人體和其他非目標(biāo)生物包括昆蟲寄生蟲和捕食者無(wú)毒害作用，因而受到人們的重視[1]。然而，萊氏野村菌分生孢子粉的生產(chǎn)、在環(huán)境中的宿存能力等問題尚未獲得圓滿的解決，成為了影響其大規(guī)模開發(fā)和應(yīng)用的制約因素。本實(shí)驗(yàn)采用的萊氏野村菌Cq菌株分離于罹病家蠶，已對(duì)生物學(xué)、幾丁質(zhì)酶發(fā)酵條件及幾丁質(zhì)酶基因的克隆

2、與表達(dá)進(jìn)行了研究報(bào)道[2-4]。本研究探索了萊氏野村菌高純度分生孢子粉的生產(chǎn)，分析了大米發(fā)酵分生孢子對(duì)家蠶毒力的影響，調(diào)查了萊氏野村菌在土壤中的宿存能力和環(huán)境宿存后土壤中萊氏野村菌對(duì)家蠶毒力的影響，為萊氏野村菌的進(jìn)一步研究開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。主要的研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：
　　 1.固體發(fā)酵與產(chǎn)孢條件優(yōu)化
　　 以適度熟化的大米作為萊氏野村菌固體發(fā)酵的產(chǎn)孢基質(zhì)，研究了米料不同裝量厚度、補(bǔ)充氮源及氮源的添加量和補(bǔ)充水量對(duì)萊

3、氏野村菌氣生分生孢子的產(chǎn)粉量、含水量及產(chǎn)孢量的影響。結(jié)果表明，萊氏野村菌的生長(zhǎng)需要一定量的氮源，在毫無(wú)氮源的大米培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，雖可見有大量白色菌絲布滿基質(zhì)表面，但是即使培養(yǎng)26天也未見孢子產(chǎn)生；在大米中添加一定量的蛋白胨，酵母和硝酸鉀都能提高萊氏野村菌孢子粉的產(chǎn)量，但是硝酸鉀和蛋白胨對(duì)萊氏野村菌產(chǎn)孢的促進(jìn)作用明顯高于酵母，而從使用價(jià)格方面考慮，硝酸鉀顯然更適合作為大米的補(bǔ)充氮源；在直徑為15cm的培養(yǎng)皿中，每皿裝料90g時(shí)萊氏野村菌的

4、產(chǎn)孢數(shù)達(dá)到最大，為0.91×109個(gè)孢子/g；硝酸鉀添加量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，萊氏野村菌產(chǎn)粉量隨著硝酸鉀的添加量的增加而逐漸增大，0.8％添加量處理時(shí)達(dá)到最大值29.41mg/g，而后增加硝酸鉀的添加量，萊氏野村菌產(chǎn)粉量反而降低了；添水量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，萊氏野村菌在每100g大米中添加1.5mL水處理時(shí)產(chǎn)孢數(shù)最大，為3.6×109個(gè)孢子/g。
　　 2.固體發(fā)酵分生孢子的毒力
　　 收集大米發(fā)酵獲得的分生孢子粉，用0.02％的滅

5、菌吐溫-80配置成濃度分別為1.0×108個(gè)/mL、1.0×107個(gè)/mL、1.0×106個(gè)/mL、1.0×105個(gè)/mL、1.0×104個(gè)/mL、1.0×103個(gè)/mL的分生孢子懸液，感染四齡家蠶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：大米發(fā)酵所得的萊氏野村菌分生孢子保持了良好的毒力，生物測(cè)定結(jié)果表明，大米發(fā)酵所得的萊氏野村菌分生孢子懸浮液對(duì)家蠶的致死中濃度LC50為1mL1.43×105個(gè)，比斜面培養(yǎng)的萊氏野村菌分生孢子懸液對(duì)家蠶致死中濃度LC50為1mL

6、1.33×105個(gè)略大，但是兩者差異不顯著，在1.0×105-1.0×100個(gè)分生孢子/mL濃度下，大米發(fā)酵所得分生孢子的LT50=9.81-14.88天，斜面培養(yǎng)分生孢子的LT50=9.88-14.94天，兩者也不存在顯著性差異，由此可見，利用大米對(duì)萊氏野村菌進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)保持了其原有的毒力。
　　 3.土壤中的宿存動(dòng)態(tài)與毒力變化
　　 將萊氏野村菌分生孢子與土壤混合，分別放置于室內(nèi)及室外環(huán)境儲(chǔ)存，在210d內(nèi)利用

7、選擇性培養(yǎng)基定期檢測(cè)土壤中的萊氏野村菌密度，并測(cè)定宿存對(duì)萊氏野村菌毒力的影響。結(jié)果表明：萊氏野村菌分生孢子在土壤中能夠存活180d以上，土壤中有活力的萊氏野村菌的濃度隨著宿存時(shí)間的增加而減少，室內(nèi)及室外儲(chǔ)存的土壤中萊氏野村菌的成菌落數(shù)從最初的17667±655×104CFUs/g分別減少到最后的3×104CFUs/g及2×104CFUs/g。在環(huán)境中宿存60天后，土壤中萊氏野村菌對(duì)家蠶保持著很強(qiáng)的毒力，家蠶的死亡率均達(dá)到90％以上；但1