萊氏野村菌微菌核的形態(tài)發(fā)育分子機(jī)理與液體發(fā)酵的研究.pdf_第1頁(yè)
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1、萊氏野村菌[ Nomuraea rileyi(Farlow) Samson]是一種環(huán)境友好的蟲生真菌,在田間自然感染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)和煙青蟲(Heliothis assulta)等多種夜蛾科害蟲,引起害蟲域內(nèi)流行病,具有潛在的應(yīng)用前景。但萊氏野村菌因產(chǎn)孢條件苛刻,導(dǎo)致生產(chǎn)成本偏高,產(chǎn)業(yè)化難度大;而普通

2、液體發(fā)酵的芽生孢子因毒力低、不耐儲(chǔ)存等缺陷,至今國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有注冊(cè)登記產(chǎn)品問(wèn)世,嚴(yán)重制約了萊氏野村菌的產(chǎn)業(yè)化和應(yīng)用。因此,尋找一種替代分生孢子的侵染體是十分必要的,其具有抗逆、耐貯、適合規(guī)?;a(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)。微菌核是菌絲聚集而形成特異休眠體結(jié)構(gòu),作為多種植物病原真菌的繁殖體抵抗不良的環(huán)境。在適宜的環(huán)境下能夠萌發(fā)產(chǎn)生的菌絲和孢子可以作為有效的侵染體。重慶大學(xué)基因中心成功實(shí)現(xiàn)了萊氏野村菌微菌核液體誘導(dǎo)培養(yǎng),然而微菌核的形態(tài)發(fā)育分子機(jī)理及批量發(fā)酵工

3、藝尚無(wú)人問(wèn)津。
  本研究在野村菌液體微菌核誘導(dǎo)形成的基礎(chǔ)上,旨在從微菌核的形成分子機(jī)理、優(yōu)化發(fā)育過(guò)程、發(fā)酵工藝優(yōu)化開(kāi)展研究,以期證實(shí)微菌核能夠作為野村菌新制劑的活性成分(母藥),探索分子發(fā)育調(diào)控機(jī)理,實(shí)現(xiàn)液體規(guī)?;l(fā)酵,進(jìn)而推動(dòng)野村菌的產(chǎn)品研制,促進(jìn)野村菌的產(chǎn)業(yè)化。
  取得的主要研究結(jié)果如下:
  1)微菌核培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)成分的優(yōu)化
  為提高微菌核產(chǎn)量,通過(guò)單因素對(duì)微菌核的誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化篩選。在此基礎(chǔ)上,選擇

4、碳源、氮源、主要微量元素對(duì)微菌核發(fā)育有促進(jìn)作用的3因素和3較優(yōu)水平進(jìn)行正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)[L9(3)3]。微菌核的最佳培養(yǎng)基培養(yǎng)為葡萄糖:32.0g/l;檸檬酸銨:2.0g/l;硫酸亞鐵:0.15g/l,其它離子元素也不可缺少。這三個(gè)營(yíng)養(yǎng)元素對(duì)微菌核形成的影響次序?yàn)椋毫蛩醽嗚F>葡萄糖>檸檬酸銨。因此鐵離子是影響微菌核發(fā)育的最主要營(yíng)養(yǎng)因子。
  2)萊氏野村菌微菌核發(fā)育及生物學(xué)特性分析
  收集優(yōu)化培養(yǎng)基中培養(yǎng)的微菌核,對(duì)微菌核的生

5、物學(xué)特性,包括耐熱能力、貨架期、侵染能力分別進(jìn)行評(píng)估分析。結(jié)果表明微菌核具有可持續(xù)的侵染能力,并且比分生孢子具有較高的耐熱能力。在室溫放置1年后,仍具有86.4%的萌發(fā)能力。結(jié)果表明微菌核能夠替代分生孢子,作為萊氏野村菌母藥的有效成分。
  3)比較轉(zhuǎn)錄組研究微菌核的發(fā)育分子機(jī)理
  為研究微菌核發(fā)育分子機(jī)理,采用比較轉(zhuǎn)錄組法對(duì)微菌核發(fā)育過(guò)程中表達(dá)基因進(jìn)行高通量測(cè)序。共獲得了由4.69 Gb核酸組成的32,061個(gè)序列,其中

6、20,919個(gè)序列(65%)得到注釋。在這些序列中,僅有5,928個(gè)序列注釋34個(gè)基因功能分類,有12,778個(gè)序列匹配到165條KEGG途徑。兩個(gè)轉(zhuǎn)錄組中共發(fā)現(xiàn)了4,808個(gè)差異表達(dá)基因,其中有719個(gè)差異表達(dá)基因注釋了25個(gè)基因功能分類,1,888個(gè)差異表達(dá)基因匹配了161條KEGG途徑,其中包含25條富集KEGG途徑。通過(guò)對(duì)富集KEGG中上調(diào)或者特異表達(dá)的基因進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)這些基因均在氧脅迫解毒方面發(fā)揮共性作用。為驗(yàn)證這一發(fā)現(xiàn),對(duì)

7、這些上調(diào)基因進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證。結(jié)果顯示微菌核發(fā)育過(guò)程中伴隨著氧脅迫的發(fā)生,同時(shí)一系列代謝發(fā)生著顯著變化。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為研究萊氏野村菌微菌核發(fā)育提供了大量的基因信息。
  4)調(diào)控微菌核發(fā)育的功能基因鑒定
  跨膜蛋白(Sho1p和Sln1p)在感受生長(zhǎng)壓力和調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)對(duì)環(huán)境壓力方面發(fā)揮著重要的功能。我們首先檢測(cè)了微菌核發(fā)育過(guò)程中環(huán)境的變化以及對(duì)微菌核發(fā)育的影響。另一方面,我們克隆了跨膜蛋白的兩個(gè)基因(sho1和sln1)

8、,它們分別編碼了306個(gè)和1118個(gè)氨基酸序列。在應(yīng)對(duì)微菌核發(fā)育過(guò)程中變化的微環(huán)境,兩個(gè)基因表達(dá)量均上調(diào)。為確認(rèn)sho1和sln1基因功能,我們通過(guò)RNA干擾技術(shù)分別構(gòu)建了RNA干擾體(單干擾體:sholRM, sln1RM和雙干擾體 shol&sln1RM)。這些干擾體對(duì)滲透壓和氧脅迫敏感,導(dǎo)致生長(zhǎng)速度、產(chǎn)孢量和微菌核形成數(shù)量顯著下降。研究結(jié)果顯示:sho1和sln1基因在萊氏野村菌應(yīng)答生長(zhǎng)壓力進(jìn)而調(diào)控微菌核的發(fā)育方面發(fā)揮著重要功能。

9、
  5)微菌核培養(yǎng)條件的優(yōu)化
  選擇轉(zhuǎn)速、接種濃度、起始pH和培養(yǎng)溫度進(jìn)行影響微菌核液體發(fā)酵關(guān)鍵條件篩選試驗(yàn),其中轉(zhuǎn)速、接種濃度和培養(yǎng)溫度三個(gè)因素為影響微菌核液體發(fā)酵關(guān)鍵條件的主要因素。其后對(duì)這三個(gè)主要因素采用23的中心組合和響應(yīng)面法設(shè)計(jì)試驗(yàn),獲得了影響微菌核產(chǎn)量的因素多項(xiàng)式,表明轉(zhuǎn)速和接種濃度是更為重要的因素。
  6)微菌核批量發(fā)酵工藝的建立及優(yōu)化
  利用不同類型的接種體、不同培養(yǎng)時(shí)間的接種體和不同接種

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