萊氏野村菌Nrssk1與Nrpbs2基因的克隆和功能研究.pdf

1、萊氏野村菌（Nomuraea rileyi=Metarhizium rileyi）是一種分布廣泛的蟲生真菌，因其在自然環(huán)境中可以感染多種鱗翅目的害蟲，可以作為潛在的生物殺蟲劑而逐漸受到關(guān)注。但是萊氏野村菌分生孢子的產(chǎn)孢需要一定的光照溫度等苛刻條件，且不耐儲存，這對于以分生孢子作為殺蟲制劑有效成分的真菌來說，是制約其工業(yè)化生產(chǎn)的重要因素。本實驗室經(jīng)過長期的研究成功實現(xiàn)了萊氏野村菌微菌核的人工誘導(dǎo)，微菌核具有生產(chǎn)成本低、耐高溫、耐儲存、可持

2、續(xù)侵染等特點，因此可以作為分生孢子的有效替代品用于殺蟲制劑的生產(chǎn)。
　　本實驗室在2012年采用比較轉(zhuǎn)錄組技術(shù)研究微菌核形成的分子機理，發(fā)現(xiàn)在微菌核發(fā)育過程中伴隨著活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生。而已有研究表明真菌在應(yīng)對外部滲透和氧脅迫壓力時，兩個跨膜蛋白Sholp和Sln1p發(fā)揮重要的感受作用，這兩個蛋白分別將信號傳遞給高滲透壓甘油信號途徑(High osmolarity glycerol

3、，HOG)。另一方面，前期研究表明，萊氏野村菌Nrsho1和Nrsln1基因在調(diào)控微菌核的發(fā)育方面發(fā)揮著重要功能。鑒于此，本文以萊氏野村菌為研究對象，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組EST庫信息，成功克隆得到HOG通路中Nrsho1與Nrsln1的下游基因Nrssk1與Nrpbs2基因，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的萊氏野村菌的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，成功對兩個基因進行了單敲除，并研究其基因功能，得到如下的研究結(jié)果：
　?、貼rssk1與Nrpbs2基因的克隆與序列分析

4、>　　根據(jù)萊氏野村菌轉(zhuǎn)錄組文庫Unigene序列，成功克隆出了萊氏野村菌Nrssk1與Nrpbs2基因的部分序列，并利用FPNI-PCR方法擴增得到其基因全長序列，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)：Nrssk1開放閱讀框長2929bp，含有2個內(nèi)含子，編碼929個氨基酸，其蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為100.2kDa，理論等電點為10.04；Nrpbs2開放閱讀框長2038bp，含有1個內(nèi)含子，編碼649個氨基酸，其蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為68.5kDa，理論等電點為5.80。

5、其二級結(jié)構(gòu)以隨機卷曲和α螺旋為主要構(gòu)象。Nrssk1p隸屬于REC超家族，該家族蛋白含有信號接收結(jié)構(gòu)域；Nrpbs2p隸屬于類PKc超家族，該蛋白激酶超家族主要由絲氨酸/蘇氨酸特異性和酪氨酸特異性蛋白激酶的催化結(jié)構(gòu)域組成。經(jīng)過同原序列比對與系統(tǒng)進化分析，我們發(fā)現(xiàn)Nrssk1與Nrpbs2基因在進化關(guān)系上與綠僵菌屬ssk1與pbs2基因有最近的親緣關(guān)系。
　　②Nrssk1與Nrpbs2敲除載體構(gòu)建和突變菌株篩選
　　采用同源

6、雙交換的方法，通過FPNI-PCR的方法擴增兩個基因編碼區(qū)相鄰的上下游同源序列，結(jié)果分別擴增得到1500bp左右的未知序列，并以此構(gòu)建得到Pzp-Ptrpc-Hph-Nrssk1和Pzp-Ptrpc-Hph-Nrpbs2基因敲除載體。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的萊氏野村菌的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)化萊氏野村菌芽生孢子，篩選得到了突變菌株△Nrssk1與△Nrpbs2。
　?、弁蛔兙甑谋硇头治?br>　　分析兩個突變菌株的表型相對于野生型菌株的變化，我

7、們發(fā)現(xiàn)，△Nrpbs2整體生長進程特別是分生孢子萌發(fā)的前期相較于野生型明顯延遲，在培養(yǎng)后期，菌絲豐厚，分生孢子梗分叉較多，產(chǎn)孢困難，產(chǎn)孢量較野生型顯著降低?！鱊rssk1相較于野生型在菌體發(fā)育方面沒有明顯變化。在逆境脅迫實驗中，△Nrpbs2對滲透壓脅迫敏感，菌絲生長受到抑制，且對鹽離子濃度的極限耐受力下降。在應(yīng)對氧脅迫，尤其是在甲萘醌提供的氧脅迫環(huán)境中，△Nrpbs2的生長受到了較大的限制，其生長進程發(fā)生了較明顯的延遲。而△Nrssk

8、1則只有在較高程度的滲透壓脅迫和氧脅迫下，菌落才出現(xiàn)了較野生型明顯的變化，菌株的生長受到限制，產(chǎn)孢量不同程度的下降。另外，兩個突變菌株對濕熱脅迫均不敏感。在微菌核的誘導(dǎo)實驗中，相比于野生型微菌核，△Nrssk1的微菌核相比于野生型微菌核，色素沉積下降，且致密程度也變得更為疏松；這一點在△Nrpbs2菌株中變得更為明顯，其色素的下降程度可在肉眼觀察下感知。并且，兩個突變菌株在微菌核的產(chǎn)量（數(shù)量）及總生物量上均有顯著下降。以上說明兩個基因?qū)?/p>

9、萊氏野村菌應(yīng)對多種壓力脅迫以及微菌核的正常生長發(fā)育是必須的。
　?、躈rssk1與Nrpbs2表達模式分析
　　收集萊氏野村菌在微菌核發(fā)育的幾個時期的樣品，并利用實時熒光定量 PCR分析兩個基因在這幾個時期的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Nrssk1與Nrpbs2兩個基因萊氏野村菌微菌核發(fā)育過程中有著相似的表達趨勢，在微菌核誘導(dǎo)的初期36h，兩基因均有較高水平的表達，之后均有下降，并在第84h達到最高的表達水平，此時正處于微菌核形成的

10、高峰期，這說明兩基因均參與微菌核的發(fā)育并發(fā)揮了一定的作用。
　　當(dāng)以突變菌株進行微菌核的誘導(dǎo)并以實時熒光定量PCR分析基因缺失對其他基因的影響時，我們發(fā)現(xiàn)兩基因會在一定程度上協(xié)同發(fā)揮作用，并與CWI通路發(fā)生作用互補。
　?、萃蛔兙甓玖Ψ治?br>　　將突變菌株的分生孢子分別以體表點滴和體內(nèi)注射的方式侵染斜紋夜蛾三齡幼蟲測定突變菌株的毒力變化，結(jié)果表明，△Nrssk1菌株的半致死時間LT50分別為6.18d和6.43d相比野

11、生型增長了1.18d和1.36d；△Nrpbs2菌株的半致死時間LT50分別為6.83d和6.97d，相比對野生型菌株增長了1.83d和1.90d。這說明兩基因均在一定程度上影響這萊氏野村菌對斜紋夜蛾幼蟲的侵染毒力。
　　⑥結(jié)論
　　以上結(jié)果表明，Nrssk1與Nrpbs2兩個基因在萊氏野村菌應(yīng)對外界脅迫、微菌核的發(fā)育以及菌株的毒力方面均發(fā)揮一定的作用，且其功能又有相似之處，但發(fā)揮作用的程度并不一樣，而這也是符合兩基因在HO