萊氏野村菌兩型轉換的初步研究.pdf

1、近年來對以蟲生真菌為代表的生物農藥的相關研究逐漸成為研究熱點。這其中就包括萊氏野村菌（Nomuraea rileyi），它能夠侵染多種鱗翅目昆蟲，特別是夜蛾科害蟲，在田間能引發(fā)害蟲的流行病，具有潛在應用價值。
　　萊氏野村菌在自然侵染和人工培養(yǎng)生長過程中呈現(xiàn)兩型生長，即前期以酵母態(tài)細胞進行增殖，然后再轉換為菌絲，進而產生分生孢子。對其兩型生長研究有助于揭示其兩型轉換機制，指導生產應用。而且萊氏野村菌酵母型細胞可作為良好受體細胞，用

2、于遺傳轉化體系的構建和基因敲除、回復和超表達。目前真菌兩型態(tài)生長研究主要集中在人類致病菌，野村菌等蟲生真菌的兩型轉換調控機理研究寥寥無幾。本研究在詳細觀察萊氏野村菌兩型轉換過程的基礎上，對現(xiàn)有制備萊氏野村菌酵母型細胞的劃線法進行優(yōu)化改良，獲得了酵母型孢子同步大量制備技術；利用比較轉錄組技術，分析兩型轉化過程中差異表達基因，探索兩型轉換的分子調控機理，找出并驗證兩型轉換的關鍵調控因素。研究為滿足萊氏野村菌遺傳轉化操作需求提供了有效方法，并

3、為野村菌兩型轉換機制研究奠定了基礎。取得主要研究結果如下：
　?、賰?yōu)化酵母型細胞制備方法
　　為提高酵母型細胞得率，通過單因素對制備方法進行優(yōu)化。結果發(fā)現(xiàn)，冷藏保存3個月內的分生孢子均可用于萊氏野村菌酵母型細胞的制備。1％瓊脂濃度可以提供合適的培養(yǎng)基硬度，產生相對較長的酵母型細胞生長期和收獲時間窗口。接種密度、培養(yǎng)基瓊脂濃度等因素均影響到酵母型細胞的生長期、生長同步性。采取臨空播撒接種可以充分分散分生孢子，降低接種密度，形成

4、酵母型細胞菌落數(shù)量較多而且生長大體同步。
　?、谌R氏野村菌在固體培養(yǎng)基上的兩型轉換過程
　　采用優(yōu)化后的方法制備酵母細胞接種至SMAY培養(yǎng)基表面，菌落和顯微水平觀察并描述其兩型生長，確定在該實驗環(huán)境下，12小時以內為萊氏野村菌酵母型細胞生長階段，24-96小時為酵母型向菌絲型轉換階段，96-168小時為兩型轉換結束階段。
　?、廴R氏野村菌兩型轉換過程的轉錄組學分析
　　采用現(xiàn)代測序技術對兩型生長過程中酵母型細胞和

5、兩型轉換初期細胞進行比較轉錄組學分析。累計獲得了4.40 Gb核苷酸數(shù)據，拼接形成20,165個unigene序列，經多個數(shù)據庫比對分析，其中14,484個序列(71.83%)已經被注釋。共計6,559個序列分別屬于40個基因功能大類，8,957個序列經注釋屬于108個KEGG通路。兩個轉錄組內共有6,048個差異表達基因，其中有2,023個差異表達基因被納入25個基因功能分類，2,931個差異表達基因經注釋屬于108條KEGG通路，富

6、集KEGG途徑則為5條。通過重點分析富集KEGG途徑中上調和特異表達基因，發(fā)現(xiàn)RIM101途徑、磷脂酰肌醇途徑等多個調控途徑和基因參與萊氏野村菌的形態(tài)轉換，并對這些基因進行了熒光定量PCR驗證。結果表明在兩型轉換過程中，多個調控途徑和相關基因參與其中，同時細胞骨架、細胞表面成分等也出現(xiàn)了變化。所獲得基因信息為深入研究萊氏野村菌兩型轉換的分子調控機理提供了重要線索和參考依據。
　?、?pH是影響萊氏野村菌兩型轉換的重要因素
　

7、　依據比較轉錄組學分析結果發(fā)現(xiàn)，環(huán)境pH響應相關RIM101途徑在萊氏野村菌兩型轉換期顯著上調表達，由此推測環(huán)境pH值是影響萊氏野村菌兩型轉換的一個重要因素，隨后采用pH梯度培養(yǎng)試驗進行驗證。菌落和顯微觀察結果證明，在一定pH范圍內，酸性環(huán)境可使萊氏野村菌的兩型轉換加快；在中性和堿性環(huán)境下，萊氏野村菌會在較長時間內保持酵母型細胞生長狀態(tài)，菌絲型菌體推遲形成。
　　結論：萊氏野村菌兩型轉換受環(huán)境pH和細胞密度調控，并受到培養(yǎng)基瓊脂濃