萊氏野村菌的發(fā)酵工藝與田間應(yīng)用潛力評測.pdf

1、萊氏野村菌（Nomuraea rileyi (Farlow)Samson）是一種重要的昆蟲病原真菌，國內(nèi)外在該菌的生物學(xué)、流行病學(xué)等研究領(lǐng)域有較多的研究，但在國內(nèi)至今尚無商品制劑注冊。本研究在前人的研究基礎(chǔ)上，對萊氏野村菌菌株的發(fā)酵工藝進行了進一步的研究，包括萊氏野村菌液體培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)觀察、固體培養(yǎng)基的優(yōu)化與發(fā)酵工藝研究等；
　　 同時通過眾多菌株的室內(nèi)毒力測定，篩選出對斜紋夜蛾（Spodoptera litura）、甜菜夜蛾（

2、Spodoptera exgua）、棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）等3種夜蛾科害蟲具有高毒力的菌株，并對高毒力菌株的田間應(yīng)用技術(shù)及效果進行了研究與田間評測。
　　 萊氏野村菌的固體發(fā)酵工藝是該菌培養(yǎng)及工業(yè)化生產(chǎn)中的瓶頸問題。本研究從萊氏野村菌培養(yǎng)基配方入手，優(yōu)化培養(yǎng)基配方，以獲得更高的發(fā)酵效率。研究中用單因子篩選法從面粉、大米、黃豆粉、棉子粉、燕麥粉等幾種農(nóng)產(chǎn)品中篩選出萊氏野村菌菌株固體發(fā)酵的最佳基質(zhì)。同時，

3、通過在基本培養(yǎng)基質(zhì)中加入不同的黃粉蟲粉、酵母粉、蛋白胨等氮源，比較孢子得率，從中篩選出能促進萊氏野村菌生長、產(chǎn)孢的最佳氮源。另外，通過在篩選出的培養(yǎng)基質(zhì)中加入葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、果糖等不同的碳源，比較孢子利率，確定最佳碳源。實驗結(jié)果顯示：在棉籽粉中加入2％的酵母粉和3％乳糖可以作為萊氏野村菌較適宜固體發(fā)酵培養(yǎng)基，產(chǎn)孢量可達3.32±0.38×108/cm2。
　　 本文對萊氏野村菌的淺盤固體發(fā)酵工藝及薄層發(fā)酵工藝進行了研

4、究。淺盤固體發(fā)酵工藝研究中，對基本培養(yǎng)基大米和碎大豆的發(fā)酵效率進行了比較。在基本培養(yǎng)基按25％接種量接種培養(yǎng)3d的萊氏野村菌SMY 培養(yǎng)液，攪拌均勻后，鋪淺盤進行固體發(fā)酵，料厚1cm，然后置于25±1℃下光照培養(yǎng)，培養(yǎng)10d，以使其充分產(chǎn)孢。產(chǎn)孢量測定結(jié)果為：以大米為培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量為0.4±0.22×108 孢子/g，而以碎大豆為培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量則達到6±1.83×108孢子/g。
　　 在薄層發(fā)酵工藝中，以6％的棉籽粉、2％酵母

5、粉、1.5％瓊脂為配方制備培養(yǎng)基，高溫滅菌手噴涂到塑料平板托盤上，待其冷卻凝固后，噴霧接種萊氏野村菌孢子懸浮液。為避免培養(yǎng)基在發(fā)酵過程中的水份蒸發(fā)，將接種后的托盤用保鮮膜密封后，置于25±1℃下光照培養(yǎng)。薄層發(fā)酵工藝在第10d的產(chǎn)孢量可達2.45±0.16×108孢子/cm2，且此時薄層噴涂的培養(yǎng)基中已利用充分，極易干燥及收孢。
　　 高毒力萊氏野村菌菌株的篩選是進行后繼應(yīng)用研究及產(chǎn)品開發(fā)的基礎(chǔ)。本文在前期粗篩的基礎(chǔ)上，確定了N

6、r03、Nr06、Nr09、Nr11和Nr15等5株萊氏野村菌為進一步研究對象。用噴霧法對斜紋夜蛾、甜菜夜蛾和棉鈴蟲等3 種夜蛾科害蟲進行進一步的室內(nèi)毒力測定。在孢子懸浮液濃度分別為1×105、1×106、1×107孢子/mL2，噴霧塔霧化接種時單位面積的孢子附著量為188.9～4048.3 孢子/mm2。時間-劑量-死亡率模型分析顯示：5株萊氏野村菌菌株Nr03、Nr06、Nr09、Nr11、Nr15在188.9～4048.3孢子/m

7、m2接種量范圍時，斜紋夜蛾第10d時的死亡率為60％～95％，其中菌株Nr15對斜紋夜蛾的毒力水平最高，第10d時的侵染率達到95％。Nr15菌株對斜紋夜蛾的半致死濃度（LC50）為266.7孢子/mm2，而在4048.3孢子/mm2濃度下的半致死時間（LT50）為5.81d。供試的5株萊氏野村菌菌株對棉鈴蟲與甜菜夜蛾的致病力相對較弱，侵染率均不足50％。試驗結(jié)果表明，萊氏野村菌菌株對夜蛾科害蟲體現(xiàn)出明顯的寄主?；?，對高毒力菌株呈獻明

8、顯的量效關(guān)系。本研究中篩選出了高毒力的Nr15菌株，可用于斜紋夜蛾生物防治的后繼研究。
　　 萊氏野村菌Nr15菌株的田間試驗設(shè)置了1×108、1×107孢子/ml兩個處理濃度及1個空白對照。用超低量噴霧的方法防治白菜上的斜紋夜蛾。每天觀察記錄各小區(qū)每棵植株上的僵蟲數(shù)，直至老熟幼蟲開始化蛹為止。處理前后斜紋夜蛾死亡率（％）和較正死亡率（％）的計算結(jié)果顯示，在田間處理后第13d，處理濃度為1×107孢子/ml的處理區(qū)，死亡率（％）