煙草抗病基因篩選及其高通量RNAi載體庫的構(gòu)建.pdf

1、煙草是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，而煙草病害是煙草生產(chǎn)上的重要問題，因此發(fā)掘抗病基因用于煙草遺傳育種的研究，早在上世紀(jì)20年代已經(jīng)開始。早期煙草抗病基因的篩選大多是通過個(gè)體水平上的抗性鑒定進(jìn)行的，隨著圖位克隆尤其是植物基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來越多植物的抗病基因可以通過同源比對(duì)進(jìn)行篩選鑒定。同時(shí)，目前RNA測(cè)序(RNA-seq)已成為進(jìn)行基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄組分析的重要手段。本研究以普通煙草種紅花大金元(N.tabacum，2n=4x=48)、野

2、生種林煙草(N.sylvestris，2n=2x=24)、絨毛狀煙草(N.tomentosiformis，2n=2x=24)、耳狀煙草(N.otophora，2n=2x=24)等四個(gè)煙草種為供試材料，對(duì)開花時(shí)期的主要器官(根、莖、葉和花)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與分析。對(duì)絨毛狀煙草全基因組中NBS類基因進(jìn)行了分析，明確了煙草NBS類抗病相關(guān)基因的數(shù)量及其類型、分布特征和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)關(guān)系等。根據(jù)絨毛狀煙草基因組抗病相關(guān)R基因的生物信息分析結(jié)果，選取

3、其中的重要基因批量設(shè)計(jì)引物，利用GATEWAY表達(dá)載體構(gòu)建方法，構(gòu)建了高通量的煙草RNAi載體庫。為進(jìn)一步開展煙草抗病相關(guān)R基因的克隆及其功能的鑒定驗(yàn)證奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.在轉(zhuǎn)錄水平上絨毛狀煙草不同組織基因表達(dá)存在明顯差異
　　 本研究首次采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法，對(duì)4個(gè)煙草種的4個(gè)器官進(jìn)行了表達(dá)譜分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以絨毛狀煙草基因組和基因集為參考，絨毛狀煙草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分別有大約74％和59％的reads可

4、以比對(duì)到基因組和基因區(qū)上，其中分別有43％和35％的reads能完全進(jìn)行匹配。共有28144個(gè)基因有轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)支持，數(shù)量占全部基因集的83.5％。通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)預(yù)測(cè)基因進(jìn)行了結(jié)構(gòu)優(yōu)化，并發(fā)現(xiàn)了很多新的轉(zhuǎn)錄本和可變剪切形式。
　　 采用RPKM法定量每個(gè)基因的表達(dá)水平，結(jié)果表明不同組織中的組織特異表達(dá)基因的數(shù)量差異很大，至少有1642個(gè)基因存在組織特異性表達(dá)。其中，組織特異表達(dá)基因分布較多的器官是花，基因達(dá)到1478個(gè)；在根、莖

5、和葉組織中，特異表達(dá)的基因分別有866、179和165個(gè)。
　　 2.從絨毛狀煙草基因集中篩選出282個(gè)含NBS結(jié)構(gòu)的抗病基因
　　 根據(jù)絨毛狀煙草測(cè)序結(jié)果，通過hmmer軟件在絨毛狀煙草基因集中預(yù)測(cè)得到282個(gè)含NBS結(jié)構(gòu)的抗病基因。
　　 對(duì)獲得的所有NBS類型R基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的表達(dá)譜比較，結(jié)果表明在282個(gè)NBS類基因中共有154個(gè)基因具有轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)支持。其中，根、莖、葉和花中分別有145、134、

6、129和132個(gè)基因有表達(dá)數(shù)據(jù)。有10多個(gè)基因在四個(gè)種的組織中都呈現(xiàn)高表達(dá)，說明這類R基因可能具有廣譜抗性。
　　 此外，在林煙草、耳狀煙草和普通煙草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中分別鑒定出220、247、320個(gè)序列含有NBS結(jié)構(gòu)域。
　　 3.構(gòu)建了絨毛狀煙草NBS類抗病基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹
　　 NBS類抗病基因的系統(tǒng)發(fā)生分析表明，進(jìn)化樹除了少數(shù)幾個(gè)小的分支外，簇狀大的分枝較為明顯，基本上按照結(jié)構(gòu)類別形成較大的簇狀分枝，成簇基因

7、在進(jìn)化樹末端聚在一起，可能是近期通過復(fù)制產(chǎn)生的，表現(xiàn)出更近的親緣關(guān)系；也有部分基因呈單獨(dú)分支存在，與類別存在差異，表明煙草抗病基因發(fā)生了較為復(fù)雜的進(jìn)化過程。
　　 在絨毛狀煙草基因組鑒定出的282個(gè)NBS類型抗病基因中，136個(gè)基因在染色體上的物理位置相近或相鄰即形成基因簇。在形成的54個(gè)基因簇中，每個(gè)基因簇平均包含2.5個(gè)基因，最大的一個(gè)基因簇包含6個(gè)基因。共鑒定了11個(gè)hm同源基因，說明hm是一個(gè)多基因家族。
　　

8、4.利用GATEWAY表達(dá)載體構(gòu)建法構(gòu)建了高通量的煙草RNAi載體庫
　　 在絨毛狀煙草基因組抗病基因鑒定的基礎(chǔ)上，根據(jù)已報(bào)道的抗病基因種類和煙草EST數(shù)據(jù)以及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的支持，我們從這些抗病基因中篩選出比較完整和可靠的候選基因共186個(gè)進(jìn)行功能驗(yàn)證。
　　 利用GATEWAY表達(dá)載體構(gòu)建方法，構(gòu)建了高通量的煙草RNAi載體庫。把186條R基因干擾片段的全部或部分連接到入門載體pDONR201中，用轉(zhuǎn)化的克隆數(shù)評(píng)價(jià)煙草抗