豬繁殖與呼吸綜合征病毒HuN4-F112株GP3蛋白糖基化位點(diǎn)研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)自1987年在美國(guó)爆發(fā)以來(lái)至今已在全世界大部分地區(qū)流行。該病能引起母豬的流產(chǎn),產(chǎn)死胎、木乃伊胎,仔豬和育肥豬有明顯呼吸道癥狀,它的發(fā)生和流行對(duì)全世界的養(yǎng)豬業(yè)造成巨大打擊。2006年我國(guó)爆發(fā)的以北美洲型變異的豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndr

2、omevirus,PRRSV)為主要病原的高致病性豬藍(lán)耳病,造成各地區(qū)不同年齡階段的豬群出現(xiàn)體溫高、發(fā)病率高和高死亡率的臨床表現(xiàn),對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)予以重創(chuàng),當(dāng)前如何有效的防控PRRS成為養(yǎng)殖者及科研人員亟待解決的問題。
　　 PRRSV中GP3蛋白與GP2a、GP4以異源三聚體的形式參與形成病毒粒子,與PRRSV的保護(hù)性免疫有關(guān)。研究表明囊膜蛋白的糖基化在病毒對(duì)宿主的受體識(shí)別、入侵、免疫逃逸及病毒毒力等方面都發(fā)揮著重要的作用。GP3

3、是PRRSV中糖基化程度最高的囊膜蛋白,但是目前關(guān)于該蛋白糖基化對(duì)病毒的作用尚不夠清楚。
　　 本研究主要是以PRRSV GP3糖基化位點(diǎn)為研究對(duì)象,利用軟件分析高致病性豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征弱毒疫苗株HuN4-F112的GP3氨基酸序列,發(fā)現(xiàn)該蛋白存在7個(gè)潛在的N-連接糖基化位點(diǎn)。在HuN4-F112弱毒株感染性克隆的基礎(chǔ)上,選取N29、N42、N50、N131和N195位的糖基化位點(diǎn),采用點(diǎn)突變的方法對(duì)其進(jìn)行單點(diǎn)或多點(diǎn)組合突

4、變使其去糖基化,構(gòu)建了不同糖基化位點(diǎn)單點(diǎn)和多點(diǎn)突變的PRRSV全長(zhǎng)cDNA克隆。經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)染后在MARC-145細(xì)胞成功拯救出GP3-N29Q,GP3-N42Q,GP3-N50Q,GP3-N131Q,GP3-N29／50Q,N29／195Q六株含糖基化位點(diǎn)突變的病毒,而N29／42,N29／131,N29／50／131,N29／42／50／131／195幾種糖基化位點(diǎn)突變組合的全長(zhǎng)cDNA未能拯救出病毒。分別對(duì)救獲的包含突變位點(diǎn)的病

5、毒進(jìn)行突變位點(diǎn)測(cè)序分析,證實(shí)所拯救毒株的突變位點(diǎn)與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的位點(diǎn)一致。利用多步法繪制拯救突變株的生長(zhǎng)曲線,結(jié)果顯示N29,N42,N50,N131位糖基化位點(diǎn)單點(diǎn)突變都不會(huì)影響子代病毒的產(chǎn)生,拯救的各種突變株在細(xì)胞上的復(fù)制能力均低于親本毒HuN4-F112株,其中N50突變株的滴度低于親本毒近106倍。對(duì)未能拯救成功的全長(zhǎng)cDNA克隆N29／42,N29／131,N29／50／131,N29／42／50／131／195進(jìn)行測(cè)序分析,發(fā)現(xiàn)

6、除實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的相應(yīng)糖基化位點(diǎn)改變外,其他序列均與親本株一致。上述研究結(jié)果表明N29、N42,N50、N131位單個(gè)糖基化位點(diǎn)的突變會(huì)不同程度的影響PRRSV對(duì)細(xì)胞的感染能力,而多個(gè)糖基化位點(diǎn)同時(shí)突變消失則會(huì)影響感染性病毒粒子的形成,推測(cè)這些糖基化位點(diǎn)之間的協(xié)同作用可能是產(chǎn)生具有感染性病毒粒子所不可或缺的條件。本研究闡釋了PRRSV次要結(jié)構(gòu)蛋白GP3糖基化位點(diǎn)的作用,為后續(xù)研究糖基化對(duì)PRRS病毒粒子形成,致病性及免疫逃逸等方面的影響提供思