豬繁殖與呼吸綜合征病毒BJ-4株GP3截短蛋白的原核表達(dá)及T細(xì)胞表位的初步篩選.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiration Syndrome,PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的一種高度接觸性傳染病，其主要特征是引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎和仔豬呼吸困難等。由于其引起免疫抑制和繼發(fā)性感染，再加上生產(chǎn)上所用的PRRSV疫苗免疫效果不佳或無免疫保護(hù)作用，所以PRRSV一直是嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的重要病原之一。而前人的研究結(jié)果表明，激發(fā)機(jī)體T細(xì)胞免疫反應(yīng)有利于抑制PR

2、RSV復(fù)制或者控制PRRS疫情，而由PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白GP3誘導(dǎo)的T細(xì)胞免疫反應(yīng)具有良好的免疫保護(hù)效果。因此篩選GP3蛋白的T細(xì)胞表位，并在此基礎(chǔ)上，研發(fā)預(yù)防或治療PRRSV的分子藥物，這對PRRSV的防控意義重大。
　　本實(shí)驗(yàn)首先根據(jù)GenBank中PRRSV BJ-4 ORF3的基因序列設(shè)計(jì)其上下游引物，上下游引物的酶切位點(diǎn)分別是EcoRⅠ和HindⅢ，然后使用RT-PCR的方法擴(kuò)增ORF3基因全長，長度約765bp，再將其與

3、克隆載體pMD19-T連接并送至生物公司進(jìn)行測序，以測序正確的重組質(zhì)粒pMD19-T-ORF3為模板擴(kuò)增缺失N末端疏水序列的基因片段tGP3（truncated GP3），將其亞克隆到pET-32a載體中構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-32a-tGP3，然后將其導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)內(nèi)，使用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并通過Western-Blot進(jìn)行鑒定，結(jié)果成功的表達(dá)了tGP3重組蛋白，大小約43KDa。接著對重組菌的表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，

4、使其能更高效的表達(dá)，同時(shí)也對重組蛋白進(jìn)行可溶性分析，發(fā)現(xiàn)它以包涵體的形式存在。于是對重組菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并使用尿素梯度法對獲得的大量重組蛋白進(jìn)行純化，通過SDS-PAGE電泳分析純化的目的蛋白的純度，結(jié)果顯示蛋白條帶單一，即目的蛋白純度較高。使用ELISA方法，將純化的重組蛋白與PRRSV陽性血清和陰性血清進(jìn)行反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)重組蛋白能很好的與PRRSV陽性血清結(jié)合，即獲得目的蛋白具有良好的免疫原性。
　　按照9個(gè)氨基酸重疊合成總長度為

5、18個(gè)氨基酸的方法，將截短的GP3蛋白分成24個(gè)肽段并交予生物公司合成，將合成的肽段按照3-5個(gè)為一組分成5個(gè)肽庫。將純化的tGP3重組蛋白對4-6周齡的Balb/c小鼠進(jìn)行免疫，并設(shè)立0M尿素對照組。共免疫4次，第四次免疫之后1星期，對兩組小鼠剪尾采血，通過ELISA方法，檢測血清中抗tGP3蛋白多抗血清的效價(jià)，發(fā)現(xiàn)純化的tGP3重組蛋白能夠強(qiáng)烈的激起小鼠的體液免疫。接著分別取出多抗血清效價(jià)較高的和0M尿素組多抗血清效價(jià)較低的小鼠的脾

6、臟并分離獲得淋巴細(xì)胞，每組肽庫中的肽段均以20μg/ml的終濃度進(jìn)行體外刺激，24h后，收集細(xì)胞上清，按照IFN-γELISA試劑盒操作說明，檢測陽性鼠、陰性鼠細(xì)胞因子IFN-γ的分泌情況，結(jié)果顯示肽庫3和肽庫5對應(yīng)的陽性鼠的OD450值分別是0.339和0.371，是陰性鼠OD450值得2.1倍以上，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步表明，純化的tGP3重組蛋白免疫小鼠之后刺激其產(chǎn)生了細(xì)胞免疫，也初步證實(shí)了合成的多肽分成肽庫時(shí)，肽庫3和肽庫5即GP3蛋白