雞AvBD2成熟肽優(yōu)化基因的大腸桿菌表達(dá)及抑菌活性研究.pdf

1、雞β-防御素是一種富含半胱氨酸的小分子多肽，因其具有抗菌譜廣、抗菌機(jī)制特殊、無(wú)殘留等特點(diǎn)，在畜牧業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。雞β-防御素-2(AvBD2)是雞源抗菌肽中的一種，主要分布于骨髓和肺中，對(duì)病原微生物具有較強(qiáng)的殺傷作用。
　　 本研究以雞AvBD2為研究對(duì)象，參考大腸桿菌偏愛(ài)密碼子，人工合成AvBD2成熟肽基因，并構(gòu)建克隆載體和表達(dá)載體，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白GST-AvBD2，從誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)物濃度兩方面對(duì)誘導(dǎo)條件進(jìn)行

2、優(yōu)化，并初步研究了純化后蛋白的抑菌活性。
　　 具體內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　 1、雞β-防御素-2成熟肽基因的設(shè)計(jì)與合成
　　 根據(jù)Genbank公布的雞β-防御素-2成熟肽基因序列，參考大腸桿菌偏愛(ài)密碼子，設(shè)計(jì)并合成大腸桿菌偏愛(ài)性雞β-防御素-2成熟肽基因序列(AvBD2op)，序列兩端分別添加BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)，并構(gòu)建克隆載體pMD18-Tsimple-AvBD2op；同時(shí)人工合成雞β-防御素-2成

3、熟肽基因序列AvBD2，序列兩端分別添加NotI和EcoRI酶切位點(diǎn)，并構(gòu)建克隆載體pMD18-Tsimpie-AvBD2。
　　 2、雞β-防御素-2融合蛋白的表達(dá)與純化
　　 雞AvBD2成熟肽片段、密碼子優(yōu)化后成熟肽片段AvBD2op和pGEX-6P-1空載體雙酶切后連接，構(gòu)建表達(dá)載體pGEX-6P-1-Ga12和pGEX-6P-1-Ga12op，并分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21，培養(yǎng)PCR鑒定的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子后提取質(zhì)粒測(cè)

4、序，經(jīng)BLAST比對(duì)，構(gòu)建的表達(dá)載體中成熟肽片段的同源性為100％。挑取陽(yáng)性克隆培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，加IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)表達(dá)的融合蛋白分子量約為30kD。表達(dá)重組子在20℃經(jīng)0.5mmol/LIPTG誘導(dǎo)5h后可溶性融合蛋白得到最佳表達(dá)。用GST純化樹(shù)脂純化可溶性融合蛋白后得到單一條帶，BCA法測(cè)定純化后的蛋白濃度，結(jié)果顯示密碼子優(yōu)化株的蛋白表達(dá)量有較大程度的提高。
　　 3、雞β-防御素-2融合蛋白抑菌

5、活性的研究
　　 用瓊脂孔穴擴(kuò)散抑菌法檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物體外抑菌活性，結(jié)果顯示GST-AvBD2融合蛋白對(duì)糞腸球菌(ATCC29212)、雞白痢沙門(mén)氏菌(S2)、大腸桿菌(CMCC44102)及金黃色葡萄球菌(ATCC25923)均有抑菌活性。GST-AvBD2融合蛋白對(duì)上述細(xì)菌的最小抑菌濃度范圍為31.25～125μg/mL。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，融合蛋白作用后可引起病原菌菌體變形，菌體細(xì)胞破裂，細(xì)胞內(nèi)容物大量外泄，菌體成為不規(guī)則殘片。