凡納濱對蝦白斑綜合癥病毒感染相關基因的克隆與功能研究.pdf

1、凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei，Boone,1931)，又名南美白對蝦，屬節(jié)肢動物門(Arthropodal)、甲殼綱(Crnstacca)、十足目(Decapoda)、游泳亞目(Natantia)、對蝦科(Penaeidae)、濱對蝦屬(Litopenaeus)，是一種廣溫廣鹽性的熱帶海產(chǎn)蝦類，具有生長速度快，營養(yǎng)需求低，對養(yǎng)殖環(huán)境的適應性強，蝦體殼薄、含肉率高、肉味鮮美、經(jīng)濟價值高等優(yōu)點，是當今世界養(yǎng)殖蝦類產(chǎn)量

2、最高的三大品種之一，也是我國對蝦養(yǎng)殖區(qū)的主要養(yǎng)殖品種。目前，凡納濱對蝦在我國不論是海水，還是淡水養(yǎng)殖都取得了較大的發(fā)展，已經(jīng)成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的熱點。但是，隨著對蝦養(yǎng)殖業(yè)的大力發(fā)展，養(yǎng)殖面積和規(guī)模的不斷擴大，流行性病害也日益猖獗。對蝦白斑綜合癥病毒(White spot syndrome virus，WSSV)是導致世界范圍內(nèi)養(yǎng)殖對蝦暴發(fā)性傳染病的病毒，是對全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)危害最大的病原之一。由于WSSV傳播迅速，致死率高，危害性大，給對蝦養(yǎng)

3、殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。因此，對蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)上迫切需要對包括白斑病在內(nèi)的各種疾病的防治對策，而提高對蝦的自身免疫力，增強其機體防御機能是綜合防治的根本措施之一。 本研究以對WSSV不同抗性的凡納濱對蝦為對象，應用抑制性消減雜交等技術(shù)，構(gòu)建了凡納濱對蝦在WSSV感染前后的差異表達基因消減文庫4個，其中2個正向庫(在病毒未感染和感染后48h，以抗性家系為Tester，敏感家系為Drivel)和2個反向庫(在病毒未感染和感染后

4、48h，以敏感家系為Tester，抗性家系為Drivel)。通過對文庫克隆的隨機測序和生物信息學分析，所獲得的1049條有效ESTs被聚成193個基因簇(cluster)，其中，有132個基因簇包括兩個以上的ESTs序列(contig)，61個基因簇為單一序列(singleton)。與NCBI非冗余蛋白質(zhì)和核酸數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，在獲得的序列當中，有62％的序列與已知的基因序列具有高度的同源性(E value<10<'-5>)，

5、其中有532條ESTs在正向庫中，118條ESTs在反向庫中，而38％則無相似性。根據(jù)同源性中已知功能的蛋白基因，將基因簇主要分成9大類：免疫相關的蛋白質(zhì)和酶，信號調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)導相關因子，凋亡相關蛋白，抗氧化酶，轉(zhuǎn)運蛋白，核糖體蛋白，轉(zhuǎn)錄和翻譯相關的因子，代謝相關的因子以及其它。其中，免疫相關的蛋白和酶基因類，其成員最多，占到了總基因簇的一半以上。從中篩選鑒定了40多個差異表達的基因，其中有5個基因片段(1accase，carboxypep

6、tidase B，H<'+>-transporting ATP synthase，Acyl-ConAbinding protein(ACBP)， cortical granule protein with LDL-receptor)是在對蝦中首次獲得，均已遞交GenBank登記。此外，血藍蛋白(haemocyanin)和組織蛋白酶(cathepsin L)ESTs在兩個正向庫中出現(xiàn)頻率最高，分別為274條和54條。 在序列同源

7、性分析中，發(fā)現(xiàn)了2個lectin樣ESTs序列：一個長400bp具有C-tyPe lectin(CTL結(jié)構(gòu)，另一個長403bp與斑節(jié)對蝦的lectin PmAV，同源性較高。為了研究這兩個片段所在基因的功能，采用RACE技術(shù)克隆了這兩個凝集素基因的全長cDNA，分別將它們命名為Lvlectin4E(長637bp)和Lvlectin5D(長678bp)。ORF預測和氨基酸序列分析表明，這兩個凝集素新基因都是屬于C型凝集素，兩者均有C-ty

8、pe lectin的糖識別結(jié)構(gòu)域(carbohydrate recognition domain，CRDs)，有保守的半胱氨酸，二硫鍵和EPN或QPN特征。此外，RT-PCR方法對這兩個基因表達情況進行分析發(fā)現(xiàn)，Lvlectin4E在肝胰腺、血細胞、鰓、腸、肌肉、腦、盲囊、神經(jīng)、精管、胃等組織中均有表達，特別在肝胰腺、胃、腸、精管中表達量最高，在眼中可以檢測到其微量的表達，但在心臟組織中，則沒有檢測到。Lvlectin5D在肝、胃中有較

9、高的表達量，在鰓中有很微量的表達，而在其它組織中則沒有檢測到。 利用基因工程手段，將這兩個基因ORF分別插入到表達質(zhì)粒pQE30中，構(gòu)建了Lvlectin4E和Lvlectin5D基因重組原核表達載體(pQE30／Lvlectin 4E和pQE30／Lvlectin5D)，并進行轉(zhuǎn)化和誘導表達，經(jīng)SDS-PAGE和蛋白免疫印跡進行檢測分析，發(fā)現(xiàn)Lvlectin4E和Lvlectin5D基因的表達產(chǎn)物均分別出現(xiàn)了明顯的特異性條帶，

10、其融合表達產(chǎn)物的大小與預測的一致，進一步用Ni-NTA親和層析柱將重組蛋白純化，獲得了高含量高純度的目的蛋白，再利用分步透析進行了純化蛋白的成功復性。同時純化了一個空載pET32a表達的對照蛋白。用重組蛋白作為抗原免疫小白鼠，制備抗融合蛋白的血清，并進一步進行理化分析表明，兩個重組蛋白對魚、兔子、小鼠及雞等脊椎動物血細胞均具有凝集活性，而且這種凝血活性可被D-果糖、D-半乳糖、乳糖、D-甘露糖和D-葡萄糖和EDTA所抑制；而Ca<‘2+

11、>則對其凝血活性具有促進的作用。兩者均能促進PO活性的提高。點雜交結(jié)果顯示，Lvlectin4E和Lvlectin5D重組蛋白對WSSV表現(xiàn)出特異的親和力，其中Lvlectin4E比Lvlectin5D的親和作用更強。 通過在對蝦原代細胞和活體實驗表明，兩個重組蛋白具有一定的抗病毒作用。用WSSV濃度為10<'-3>感染凡納濱對蝦原代培養(yǎng)細胞3d后，對照組中被感染細胞有少量死亡，也有少量的碎片出現(xiàn)，而Lvlectin4E重組蛋白

12、與WSSV孵育后感染的仍無細胞死亡，但Lvlectin5D重組蛋白處理組也出現(xiàn)少量死亡；5d后，對照組中感染的細胞大量死亡，細胞碎片堆增大，而Lvlectin4E重組蛋白與WSSV孵育后感染的只有少量細胞死亡，Lvlectin5D重組蛋白處理組也出現(xiàn)較多細胞聚集成堆，部分細胞死亡，但比對照組明顯的少，而且出現(xiàn)死亡的時間也相對晚。在對蝦活體中進行重組蛋白保護試驗結(jié)果顯示，Lvlectin4E和Lvlectin5D與WSSV孵育后注射對蝦均