對蝦白斑綜合癥病毒的一種結(jié)合蛋白BP53的表達(dá)與功能研究.pdf

1、對蝦白斑綜合癥病毒(white spot syndrome virus，WSSV)自1992年首次暴發(fā)以來對全球蝦類養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重危害，是廣受關(guān)注的甲殼類病毒新種(Whispovirus)。各國相關(guān)研究的焦點逐漸轉(zhuǎn)移到WSSV蛋白質(zhì)組學(xué)方向，希望能夠找到預(yù)防和治療白斑病的有效途徑和技術(shù)手段。我們從定位參與WSSV感染的關(guān)鍵性的粘附蛋白或受體蛋白分子入手，進而利用RNAi、抗體阻斷、競爭性抑制物、小分子藥效團的開發(fā)等基因工程、轉(zhuǎn)錄工程、蛋

2、白質(zhì)工程以及新近的代謝工程技術(shù)來實現(xiàn)防治WSSV的感染。 本實驗室長期從事WSSV-VP37的功能研究，已證實它為WSSV的一個主要的粘附蛋白。通過Ni2+親和層析法和VOPBA(Virus Overlay Protein Binding Assay)技術(shù)分離到一個與WSSV-VP37有相互作用的宿主結(jié)合蛋白(binding vrotein，BP53)，MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果表明該蛋白質(zhì)和F1F0-ATP syntha

3、se βsubunit具有較高的匹配率，通過同源克隆得到凡納濱對蝦F1F0-ATP synthase βsubunit的部分cDNA序列。本論文就是以此為基礎(chǔ)開展的。 本研究主要包括3部分內(nèi)容：以原核表達(dá)的BP53-12.7蛋白為抗原制備多克隆抗體，采用免疫熒光和膠體金技術(shù)對BP53蛋白進行組織學(xué)定位，并通過感染中和實驗驗證其活性；凡納濱對蝦bp53基因在WSSV感染前后的時空性差異表達(dá)分析；3種WSSV敏感宿主ATP synt

4、hase β subunit基因全長的克隆及其系統(tǒng)樹比對分析。 本論文取得的主要研究結(jié)果如下：對同源克隆獲得的部分bp53基因進行生物信息學(xué)分析，選取其中抗原性比較高的區(qū)段進行大腸桿菌TOP10原核表達(dá)，并進行了條件優(yōu)化發(fā)酵。發(fā)酵產(chǎn)物的Tricine-SDS-PAGE和Western-blot分析表明重組蛋白是以包涵體的狀態(tài)存在的，分子量經(jīng)GEL-PRO軟件分析約為12.7KDa，在L-阿拉伯糖終濃度為0.02％，溫度為37℃時

5、表達(dá)量最大，同時Westem-blot免疫印跡證實重組蛋白BP53-12.7與DIG-WSSV有結(jié)合活性。 Tricine-SDS-PAGE大量制備重組蛋白BP53-12.7，經(jīng)Western-blot鑒定后作為抗原直接免疫新西蘭大白兔來制備抗BP53-12.7的多克隆抗體。制備的抗血清經(jīng)菌體吸附法和硫酸銨沉淀法純化以去除雜抗體分子，Western-blot和ELISA法檢測抗體的特異性和效價。結(jié)果表明抗BP53-12.7多克隆

6、抗體能特異性的識別rBP53-12.7，且效價測定結(jié)果為1:6400。多抗的制備對于后續(xù)的BP53-12.7蛋白的定位研究以及應(yīng)用于中和實驗都有重要的價值，目前WSSV-VP37結(jié)合蛋白BP53的定位研究現(xiàn)在正在進行。 分別選用(RNA Polymerase Ⅱ)RP Ⅱ和B-actin作為內(nèi)參基因，SYBR-Green Ⅰ Real-time PCR分析了BP53基因在凡納濱對蝦體內(nèi)的組織特異性表達(dá)，結(jié)果分析采用溶解曲線法和△

7、△Ct相對定量法。表達(dá)分析結(jié)果表明，結(jié)合蛋白BP53基因在鰓組織和肝胰腺組織中表達(dá)水平較高，而在血淋巴和甲殼下上皮組織中的表達(dá)水平存在差異，不同的內(nèi)參基因得到了不同的結(jié)果；證實了實驗中設(shè)立多個內(nèi)參基因有助于降低實驗系統(tǒng)誤差的必要性。目前WSSV感染后BP53基因的時空性表達(dá)分析正在進行。 改進了簡并引物設(shè)計方法，并應(yīng)用于同源克隆結(jié)合RACE技術(shù)擴增中國對蝦、日本對蝦、克氏原鰲蝦的ATP合成酶β亞基的基因全長。目前中國對蝦已經(jīng)得到

8、cDNA全長1822bp，日本對蝦和克氏原鰲蝦分別得到部分全長分別為1758bp和1369bp。對甲殼動物蝦類中中國對蝦、日本對蝦、凡納濱對蝦、克氏原鰲蝦、太平洋鰲蝦ATP合成酶p亞基的基因進行序列分析，結(jié)果表明它們的差別主要集中在3’UTR的長度，其它的元件如TATA-box、E-box、N端線粒體定位信號、AATAA加尾信號以及編碼的525個氨基酸都基本相同。對五種蝦與其它WSSV不敏感物種ATP synthase β subuni