凡納濱對(duì)蝦抗對(duì)蝦白斑綜合癥病毒感染研究.pdf

1、近20年來(lái)，對(duì)蝦白斑綜合癥病毒病一直是業(yè)內(nèi)研究的熱點(diǎn)。從最初的形態(tài)學(xué)觀察，到各種抗病毒免疫相關(guān)基因的鑒定，都傾注了研究者們的大量心血。但是到目前為止這個(gè)“謎團(tuán)”似乎還沒(méi)有揭開(kāi)的跡象。我們認(rèn)為免疫反應(yīng)是一個(gè)交互作用的復(fù)雜過(guò)程，只有從組學(xué)的角度上闡釋對(duì)蝦和病毒相互作用的分子機(jī)制，深入了解對(duì)蝦的抗病毒免疫機(jī)理，才能有的放矢地控制病毒的發(fā)生與流行。測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展為我們想法的實(shí)現(xiàn)提供了一個(gè)良好的平臺(tái)。
　　 基于Illumina/So

2、lexa高通量測(cè)序平臺(tái)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)能夠?qū)θ我馕锓N的整體轉(zhuǎn)錄組情況進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)未知和稀有轉(zhuǎn)錄本，提供最全面的轉(zhuǎn)錄組信息;數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)能夠分析不同處理狀態(tài)下的基因表達(dá)水平。與傳統(tǒng)的測(cè)序技術(shù)相比，Illumina/Solexa測(cè)序技術(shù)具有高通量，快速和準(zhǔn)確等特點(diǎn)。
　　 本研究以感染W(wǎng)SSV的凡納濱對(duì)蝦血淋巴為研究對(duì)象，應(yīng)用Illumina/Solexa高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)血淋巴的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行深度測(cè)序。使用短序列組裝軟件SOAP

3、denovo對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行從頭組裝，建立凡納濱對(duì)蝦血淋巴轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù);將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與nr、Swiss-Prot、KEGG和COG等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)、功能注釋和代謝通路分析;利用數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)對(duì)WSSV感染早期和晚期的差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選;并篩選了部分基因做功能鑒定。取得的結(jié)果和結(jié)論如下:
　　 1、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共獲得2，581多萬(wàn)條90bp的高質(zhì)量配對(duì)短序列。采用短序列組裝軟件SOAPdenovo進(jìn)行序列組裝，共獲得52，0

4、73條unigenes，平均長(zhǎng)度為520nt，N50值為745nt，測(cè)序質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果表明，除了3’端和5’端存在少量reads外，其它reads的分布都相對(duì)均一。該研究成果極大地豐富了凡納濱對(duì)蝦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，為發(fā)現(xiàn)新基因及分析差異表達(dá)基因奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　 2、在組裝獲得的52，073條unigenes中，有23，568條unigenes可以注釋到四個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù);通過(guò)GO功能注釋，共有6，562條unigenes被歸類到50個(gè)

5、功能分類中，這些功能分類主要涉及代謝相關(guān)，生長(zhǎng)和發(fā)育調(diào)控，凋亡，生物合成，免疫防御，分子加工，信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等;通過(guò)COG功能分類，共有7，822條unigenes被歸類到25個(gè)功能類別中;通過(guò)KEGG代謝通路分析，共有14，941條unigenes注釋到240個(gè)信號(hào)通路中;CDS預(yù)測(cè)表明有20，689條unigenes可以預(yù)測(cè)到蛋白編碼框，其余未被預(yù)測(cè)到蛋白編碼框的序列用ESTscan軟件進(jìn)行編碼區(qū)預(yù)測(cè)，結(jié)果表明有5，669條可能

6、為新的蛋白編碼序列;KEGG分析顯示有963條unigenes被顯著富集到各個(gè)免疫相關(guān)的信號(hào)通路中，如泛素介導(dǎo)的蛋白酶水解通路，MAPK信號(hào)通路，jak-STAT信號(hào)通路和鈣代謝信號(hào)通路等;從被注釋到的基因中篩選到約有1，179條unigenes與其它物種的免疫相關(guān)基因具有相似性。由以上結(jié)果我們可以推測(cè)對(duì)蝦的抗病毒免疫系統(tǒng)是一個(gè)由多個(gè)因子參與，涉及多個(gè)信號(hào)通路的復(fù)雜的生物反應(yīng)過(guò)程。
　　 3、利用DGE測(cè)序技術(shù)，分別對(duì)LO樣品（

7、對(duì)照樣），L1樣品（WSSV感染后5h樣品）和L2樣品（WSSV感染后48h）進(jìn)行分析，三個(gè)樣品均獲得約6千萬(wàn)條高質(zhì)量的表達(dá)序列標(biāo)簽;通過(guò)測(cè)序質(zhì)量分析，測(cè)序飽和度和均一度評(píng)價(jià)，基因覆蓋度分析，表明所獲得的tags可以用作進(jìn)一步的差異表達(dá)基因分析;將三個(gè)樣本的tags比對(duì)回轉(zhuǎn)錄組，比較分析發(fā)現(xiàn)在病毒感染的早期，僅有315個(gè)差異表達(dá)基因，包括227個(gè)上調(diào)表達(dá)基因和88個(gè)下調(diào)表達(dá)基因;而在病毒感染的晚期，共有4，226個(gè)差異表達(dá)基因，包括25

8、06個(gè)上調(diào)表達(dá)基因和1720個(gè)下調(diào)表達(dá)基因;GO功能注釋表明，這些差異基因分別富集到不可溶解部分，肽酶活性和細(xì)胞氨基酸代謝過(guò)程等GO條目中;KEGG代謝通路分析表明，病毒感染晚期的差異表達(dá)基因大多富集到細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用，補(bǔ)充和凝固級(jí)聯(lián)，抗原加工和遞呈等信號(hào)通路中;qRT-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表明所選四個(gè)基因的表達(dá)模式與DGE的測(cè)序結(jié)果趨勢(shì)一致。通過(guò)以上分析結(jié)果我們可以得知，在病毒感染的早期，對(duì)蝦的免疫反應(yīng)是遲緩的，而在病毒感染的晚期，對(duì)

9、蝦的免疫系統(tǒng)才被充分激活。
　　 4、在轉(zhuǎn)錄組和數(shù)字基因表達(dá)譜測(cè)序結(jié)果分析的基礎(chǔ)上，選取18個(gè)免疫相關(guān)基因，通過(guò)分析在嚴(yán)重感染頻死的對(duì)蝦血淋巴中這些基因的表達(dá)情況，篩選出6個(gè)表達(dá)量與對(duì)照組具有顯著性差異的基因。其中胰凝乳樣絲氨酸蛋白酶基因顯著上調(diào)表達(dá)，其余五個(gè)基因包括熱激蛋白70，對(duì)蝦肽，粘性因子，增殖細(xì)胞核抗原和Argonaute顯著下調(diào)表達(dá);體外合成胰凝乳樣絲氨酸蛋白酶的雙鏈RNA，通過(guò)注射方法沉默該基因的表達(dá)，沉默效率實(shí)驗(yàn)