對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)VP36A的原核表達(dá)及其功能的初步研究.pdf

1、對蝦白斑綜合癥病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是導(dǎo)致1992年以來世界性對蝦爆發(fā)性死亡的主要病原,至今仍給我國對蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來重大經(jīng)濟(jì)損失。目前對WSSV的研究主要集中于尋找WSSV與宿主相結(jié)合的粘附蛋白上,從而研制相應(yīng)的阻斷疫苗以達(dá)到防治目的。以前研究表明VP36A(以表觀分子量命名)是WSSV中含量很少的一個(gè)囊膜蛋白,含有RGD(Arg-Gly-Asp)細(xì)胞粘附序列,本實(shí)驗(yàn)室用噬菌體展示技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)

2、,VP36A與蝦鰓細(xì)胞膜有結(jié)合活性,還可與WSSV競爭結(jié)合對蝦鰓細(xì)胞膜,提示VP36A可能是WSSV的一個(gè)粘附蛋白。本文在此基礎(chǔ)上用原核表達(dá)的VP36A用ELISA、細(xì)胞培養(yǎng)、免疫印跡等技術(shù)繼續(xù)研究其功能。
　　 本實(shí)驗(yàn)基于中國株WSSV的vp36a基因設(shè)計(jì)了一對引物,并引入.NheI和HindⅢ酶切位點(diǎn),PCR擴(kuò)增出VP36A的基因片段,定向克隆至原核表達(dá)質(zhì)粒pBADgIIIB,經(jīng)酶切、菌落PCR鑒定后測序,表明成功構(gòu)建了原核

3、表達(dá)載體pBADgIIIB-VP36A。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌后經(jīng)L-阿拉伯糖濃度梯度和不同時(shí)間誘導(dǎo)優(yōu)化表達(dá)條件,最后確定用0.2％L-阿拉伯糖誘導(dǎo)4h,SDS-PAGE和Western Blot分析在菌體裂解沉淀中可見40KD左右的特異性條帶,表明重組VP36A以包涵體形式在大腸桿菌中得到了成功表達(dá)。大量發(fā)酵Top10-pBADgIIIB-VP36A菌體,用金屬螯合親和層析柱對rVP36A進(jìn)行了純化以繼續(xù)后續(xù)研究。
　　 從

4、VP36A序列中選取抗原性較高的兩段氨基酸序列,分別合成小肽并免疫新西蘭大白兔,得到抗血清經(jīng)親和層析純化,ELISA法檢測抗體效價(jià)均達(dá)到1:10000。用純化的抗體對重組VP36A進(jìn)行Western B10t分析,呈現(xiàn)特異性條帶,表明所制備抗體對重組VP36A均具有良好抗體反應(yīng)活性;但對病毒中的天然VP36A沒有預(yù)期的反應(yīng)條帶,其原因有待于進(jìn)一步研究。
　　 用ELISA結(jié)合實(shí)驗(yàn)和熒光顯微鏡法分別驗(yàn)證了VP36A與對蝦鰓細(xì)胞膜、

5、血淋巴細(xì)胞具有結(jié)合活性。進(jìn)一步用Far Western Blot從蝦鰓細(xì)胞膜蛋白和WSSV結(jié)構(gòu)蛋白中釣取與VP36A相互作用的蛋白,結(jié)果表明WSSV的一個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白可能與VP36A結(jié)合,對蝦鰓細(xì)胞膜的一個(gè)32KD左右蛋白可能與VP36A結(jié)合。這兩個(gè)蛋白需要進(jìn)一步用質(zhì)譜鑒定。
　　 本研究表明一個(gè)WSSV蛋白和一個(gè)對蝦鰓細(xì)胞膜蛋白和VP36A有結(jié)合作用,下一步需進(jìn)行蛋白鑒定并驗(yàn)證其結(jié)合作用,以期為WSSV的分子病毒機(jī)制研究提供一定的