豬肌肉組織特異性誘導表達系統(tǒng)的構建和檢測.pdf

1、隨著轉基因技術的發(fā)展，獲得特異性強且無生物安全隱患的高效啟動子成為研究熱點。本實驗以蛻皮素誘導系統(tǒng)為介導，在實驗室前期已經分離獲得的具有較高調控能力兼具肌肉組織特異性表達的α-actin啟動子的基礎上，將蛻皮素誘導系統(tǒng)調節(jié)質粒中可廣譜表達外源基因的CMV啟動子替換為豬肌肉特異性啟動子α-actin。構建豬肌肉特異性誘導表達系統(tǒng)，并在細胞水平上驗證該肌肉特異性誘導系統(tǒng)在表達外源基因時是否兼?zhèn)浣M織特異性和可調控性，為基因治療和外源基因在骨骼

2、肌組織的特異性表達提供實驗依據。主要研究結果如下:
　　 1.將蛻皮素誘導表達系統(tǒng)調節(jié)質粒pVgRXR中的CMV啟動子替換為豬肌肉特異性表達的α-actin啟動子，選取綠色熒光蛋白EGFP為報告基因構建誘導系統(tǒng)中的反應質粒pIND-EGFP，用于檢測雙載體表達系統(tǒng)是否可以成功表達外源基因。研究結果表明，本研究構建的肌肉特異性誘導表達系統(tǒng)可啟動外源基因的表達。
　　 2.將以上系統(tǒng)中的EGFP報告基因替換為β-半乳糖苷酶L

3、acZ基因用于檢測該系統(tǒng)的表達活性。實驗結果顯示該誘導系統(tǒng)報告基因表達量在一定的范圍內均與誘導時間和誘導劑量呈正比例關系，分別在誘導時間為72 h和誘導劑量在36μM時達到最大值，之后表達基本持平，并發(fā)現該系統(tǒng)在分化的C2C12細胞（即肌管）中的表達要極顯著高于未分化的C2C12細胞(p＜0.01)，證明了該系統(tǒng)可在肌管中特異表達。
　　 3.利用β-半乳糖苷酶LacZ基因為報告基因，將該肌肉特異性誘導表達系統(tǒng)轉染小鼠C2C12

4、細胞，通過G418篩選，成功篩選出能穩(wěn)定表達β-半乳糖苷酶基因的5株陽性單克隆細胞株，建立了可用于肌肉誘導表達的穩(wěn)定細胞系，為下一步其它實驗提供了基礎。
　　 4.構建了以豬MyoD基因為外源基因的豬肌肉特異性誘導表達系統(tǒng)pVg-actin/pIND-MyoD，將該系統(tǒng)轉染分化7天后的小鼠C2C12細胞，發(fā)現誘導劑濃度為36μM，誘導時間為48 h的實驗組中MyoD基因的表達量是未加誘導劑的對照組表達量的17倍，充分證明了該誘導