豬肌肉組織骨骼肌特異性基因a-actin啟動(dòng)子的克隆及功能驗(yàn)證.pdf

1、外源基因如何高效的在受體組織中表達(dá)是基因工程研究的關(guān)鍵。而外源基因的表達(dá)首先取決于其轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)。高等動(dòng)物基因的表達(dá)具有時(shí)間和空間性。組織特異性啟動(dòng)子又稱為器官特異性啟動(dòng)子。在這類啟動(dòng)子的作用下,基因的表達(dá)往往只限于某些特定的組織或器官,同時(shí)表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)等特性。但是到目前為止,分離和獲得利用的組織特異性啟動(dòng)子少之又少,并且伴隨著活性低組織特異性并不是很高的缺點(diǎn)。國(guó)外已分離利用的組織特異性啟動(dòng)子都有專利保護(hù),這極大了限制了我國(guó)在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

2、制藥、畜禽的品種改良及各種疾病的靶向基因治療等方面的應(yīng)用。本論文選擇了豬的骨骼肌特異性表達(dá)基因α-actin的啟動(dòng)子作為研究的對(duì)象,通過(guò)對(duì)其克隆、分離及功能驗(yàn)證獲得調(diào)控能力相對(duì)較強(qiáng)的同時(shí)又保持肌肉組織特異性的啟動(dòng)子區(qū)域,并通過(guò)構(gòu)建雙啟動(dòng)子的策略力圖改善啟動(dòng)子的活性并保證其組織特異性。為未來(lái)篩選可以高效利用的啟動(dòng)子打下基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.利用比較基因組學(xué)的方法,將豬的骨骼肌特異性表達(dá)基因α-actin的DNA序列輸

3、入NCBI的BLASTn數(shù)據(jù)庫(kù),搜索獲得此基因的上游調(diào)控序列。
　　 2.選擇豬的α-actin基因包含部分第一內(nèi)含子的上游調(diào)控序列2006bp,提交TESS、TFSEARCH及MethPrimer等生物信息學(xué)軟件對(duì)其核心啟動(dòng)子區(qū)域、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、不同轉(zhuǎn)錄元件及CpG島分布情況進(jìn)行預(yù)測(cè)預(yù)測(cè)和分析。發(fā)現(xiàn)此段序列存在啟動(dòng)子區(qū)的典型特征結(jié)構(gòu)TATA box,含有肌肉組織特異性的諸多轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合元件,如MyoD、MEF2及MyoG

4、等。
　　 3.根據(jù)生物信息學(xué)軟件在線預(yù)測(cè)的結(jié)果,設(shè)計(jì)缺失引物,以已經(jīng)擴(kuò)增獲得的2006bp的pMD18-T重組載體為模板,PCR擴(kuò)增獲得6個(gè)5’側(cè)翼缺失片段和2個(gè)3’側(cè)翼缺失片段。首先將這些片段插入到pMD18-T載體中,抽提質(zhì)粒,酶切回收目的片段,再將這些片段插入到pGL3-basic載體中的報(bào)告基因螢火蟲熒光素酶的上游多克隆位點(diǎn)處,構(gòu)建相應(yīng)的報(bào)告基因表達(dá)載體。將這些載體分別轉(zhuǎn)染C2C12、PK.及分化的C2C12細(xì)胞,通過(guò)

5、雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析報(bào)告基因螢火蟲熒光素酶的相對(duì)活性,從而獲得不同的缺失片段在相同的細(xì)胞中及相同的缺失片段在不同的細(xì)胞中啟動(dòng)活性的強(qiáng)弱。結(jié)果表明這幾個(gè)缺失片段在分化的C2C12中表達(dá)活性最高,其次是C2C12細(xì)胞,表達(dá)活性最低的是PK細(xì)胞。最終獲得了相對(duì)表達(dá)活性最高并同時(shí)保持肌肉組織特異性的268bp的核心區(qū)段。
　　 4.分別設(shè)計(jì)引物,以pIRES2-AcGFP1為模板,PCR擴(kuò)增獲得啟動(dòng)子CMV560bp、SV40231b

6、p的核心區(qū)段。
　　 5.通過(guò)添加酶切位點(diǎn)的方式,分別將啟動(dòng)子CMV、SV40及初步篩選到的豬的骨骼肌特異性表達(dá)基因α-actin啟動(dòng)子區(qū)的具備肌肉組織特異性且表達(dá)活性相對(duì)較高的區(qū)段插入到pGL3-basic載體中的報(bào)告基因螢火蟲熒光素酶的上游多克隆位點(diǎn)處,構(gòu)建四種分別包含組成型啟動(dòng)子CMV或者是SV40及豬的骨骼肌特異性表達(dá)基因α-actin啟動(dòng)子的雙啟動(dòng)子的報(bào)告基因表達(dá)載體。分別將這四種不同的表達(dá)載體利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

7、C2C12、PK及分化的C2C12細(xì)胞。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)CMV或者是SV40可顯著改善豬的骨骼肌特異性表達(dá)基因α-actin啟動(dòng)子的活性,其中啟動(dòng)子CMV的效果尤其明顯。(2)包含不同組合的雙啟動(dòng)子的表達(dá)載體在分化的C2C12細(xì)胞中表達(dá)活性最高,依次為C2C12、PK。
　　 6.以質(zhì)粒pDsRed-N1為模板,擴(kuò)增獲得攜帶酶切位點(diǎn)BglⅡ和HindⅢ的RFP片段,連至重組載體pGL3-