肌肉特異性啟動子IGF2表達(dá)載體構(gòu)建及對牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、IGF2（胰島素樣生長因子2）是一種蛋白質(zhì)，它由67個氨基酸殘基組成，在個體的生長發(fā)育過程中起重要作用，是骨骼肌生長發(fā)育的重要調(diào)控因子。近年來，對IGF2的研究逐漸深入，但是通過過表達(dá)IGF2的方式來培育高產(chǎn)、生長發(fā)育快的優(yōu)質(zhì)肉牛方面的報道較少。本研究旨在獲得帶有高效特異性啟動子的IGF2表達(dá)載體，研究其對牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(簡稱MDSCs)增殖的影響。欲提高IGF2在肌肉組織中的表達(dá)效率，首先需要獲得一個含有IGF2的高效表達(dá)的載體，其

2、中啟動子的選擇是一個重要因素。目前，巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子是外源基因在真核細(xì)胞中表達(dá)常選用的啟動子之一，該啟動子非常高效，但其幾乎不具有組織特異性，出于轉(zhuǎn)基因生物安全方面的考慮，不能將其應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因肉牛的生產(chǎn)中。所以，選取特異高效的啟動子對于外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)是必要的，本研究應(yīng)用的是實驗室前期構(gòu)建的具有特異性且活性相對較高的三種啟動子:Desminpro(300)是牛結(jié)蛋白基因啟動子，大小為300bp，活性較高，它啟動基因表

3、達(dá)的能力約為人的骨骼肌α-actin啟動子與肌酸激酶啟動子的2倍左右;CMV-MyoGpro是MyoG基因啟動子之前連接了一段CMV增強子序列，在C2C12細(xì)胞中CMV-MyoGpro復(fù)合啟動子的轉(zhuǎn)錄活性較牛MyoG啟動子提高了9倍左右，達(dá)到了強啟動子CMV啟動子的72％，在牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中，CMV增強子提高轉(zhuǎn)錄活性的效果更明顯;MyoGpro-double是含有兩個拷貝數(shù)調(diào)控元件的MyoG啟動子片段，其轉(zhuǎn)錄活性顯著高于普通MyoG基

4、因啟動子，約為MyoG基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性的3.8倍，三種啟動子都具有較高的活性和較好的肌肉特異性。本研究獲得了含上述三種有肌肉特異性啟動子的IGF2真核表達(dá)載體，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染及IGF2表達(dá)量檢測，篩選出具有較高活性和較強肌肉特異性的IGF2表達(dá)載體，并探索其對牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的調(diào)控作用。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　(1)肌肉特異性的IGF2表達(dá)載體的構(gòu)建
　　本實驗根據(jù)GeneBank中公布的牛IGF2基因序列，

5、設(shè)計引物，應(yīng)用PCR方法，以MDSCs基因組DNA為模板擴(kuò)增牛IGF2基因CDS序列，并利用實驗室前期構(gòu)建的desminpro，CMV-MyoGpro，MyoGpro-Double三種肌肉特異性啟動子構(gòu)建了pGL3-desminpro-IGF2，pGL3-CMV-MyoGpro-IGF2，pGL3-MyoGpro-Double-IGF2三種帶有肌肉特異性啟動子的IGF2真核表達(dá)載體;
　　(2)表達(dá)載體活性與特異性的篩選
　

6、　瞬時轉(zhuǎn)染MDSCs和牛胎兒成纖維細(xì)胞，RT-PCR檢測比較三種啟動子啟動IGF2基因在肌肉中的表達(dá)效率，結(jié)果表明pGL3-desminpro-IGF2是相對高效，并具有肌肉特異性的表達(dá)載體;
　　(3) EdU檢測pGL3-desminpro-IGF2轉(zhuǎn)入細(xì)胞后對MDSCs增殖的影響
　　pGL3-desminpro-IGF2載體轉(zhuǎn)入MDSCs后，EDU檢測證明pGL3-desminpro-IGF2能夠提高細(xì)胞增殖率，與對

7、照相比，增殖率為27.31％;
　　(4)檢測pGL3-desminpro-IGF2轉(zhuǎn)入細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)變化
　　RT-PCR檢測pGL3-desminpro-IGF2轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)變化發(fā)現(xiàn)IGF2是通過下調(diào)CDKs蛋白抑制因子P27的表達(dá)，上調(diào)CDK6的表達(dá)而加速細(xì)胞增殖的;為了進(jìn)一步研究IGF2的作用機(jī)理，我們通過向MDSCs中添加生長因子IGF2作用后進(jìn)行Western blot檢測，結(jié)果表明該