發(fā)菜(Nostoc flagelliforme)不同生長狀態(tài)差異蛋白質組學研究.pdf

1、發(fā)菜是一種陸生固氮藍藻，主要分布于干旱-半干旱荒漠草原地區(qū)，是當地主要的生物固氮資源和拓荒植物。本研究建立了發(fā)菜蛋白質組學研究技術，研究了日生長周期中不同生長狀態(tài)下的蛋白質表達差異、干燥失水和恢復吸水狀態(tài)下的超微結構、生理學和蛋白質表達差異，克隆了與生長發(fā)育和抗逆相關的差異蛋白(Peroxiredoxin、Mn-CAT、Ferritin和Hypothetical proteinNXL-01)基因，進行了生物信息學分析，研究其原核表達，并

2、進行了RT-PCR和Western blot驗證。
　　 1發(fā)菜蛋白質組學研究方法的建立
　　 為建立適用于發(fā)菜蛋白質組研究的雙向電泳技術，對發(fā)菜蛋白質的提取、裂解、上樣量、IEF及SDS-PAGE電泳等關鍵步驟進行了優(yōu)化，結果顯示：發(fā)菜蛋白質主要分布在pH4～7范圍內，采用改良TCA法可提高提取液中蛋白質的含量和雙向電泳圖譜的分辨率，裂解液含60 mmol/LDTT，上樣量1.3 mg/(24cm IPG膠條)時不僅提

3、高了蛋白質的溶解性，而且改善了雙向電泳的分離效果，蛋白點清晰，圖譜分辨率較好。采用優(yōu)化后的雙向電泳體系提高了發(fā)菜蛋白質雙向電泳的分辨率和重復性，建立起一套適用于發(fā)菜蛋白質組分析的雙向電泳方法。
　　 利用雙向凝膠電泳(2-DE)技術，PDQuest軟件分析圖像，基質輔助激光解析電離飛行時間串聯(lián)質譜(MALDI-TOF-TOF/MS)分析得到肽質量指紋圖譜(PMF)，通過MASCOT。和NCBI進行數據庫檢索，初步建立了發(fā)菜蛋白質

4、組學研究方法。從2-DE圖譜中選擇89個蛋白點進行蛋白質譜鑒定，共成功鑒定到68個蛋白點，代表44種蛋白，鑒定率為76.40％。57個蛋白點確定為數據庫中收錄的藍藻的蛋白，其中43個來源于已知的點形念珠藻的蛋白，7個來源于念珠藻PCC7120，2個來源于魚腥藻，3個來源于普通念珠藻，4個未鑒定出物種來源。另有3個蛋白點來源于其他物種。對發(fā)菜SOD的PMF和氨基酸序列進行了分析，表明與普通念珠藻SOD的序列覆蓋率為41％。
　　

5、2發(fā)菜日生長周期差異蛋白質組學研究
　　 在生長季節(jié)的日生長周期中，早晨發(fā)菜凈光合速率與暗呼吸速率旺盛，固氮酶和谷氨酰胺合成酶活性高，氮代謝活躍；中午隨著氣溫升高，發(fā)菜失水干燥，光照強度加大，凈光合速率與暗呼吸速率均急劇下降，固氮酶和谷氨酰胺合成酶活性降低；下午，氣溫逐漸下降，光照強度逐漸減弱，發(fā)菜再次逐漸吸收少量空氣中的水分，凈光合速率與暗呼吸速率均小幅回升，固氮酶和谷氨酰胺合成酶活性回升。
　　 運用2-DE對生長季

6、節(jié)的日生長周期中不同生長狀態(tài)發(fā)菜差異蛋白分離進行分離，在上午7:00的2-DE圖譜上共檢測到蛋白點1247個，下午13:00的2-DE圖譜上共檢測到蛋白點1164個，下午19:00的2-DE圖譜上共檢測到蛋白點1188個。3個時期2-DE圖譜的平均匹配率為71.32％。對3個時期2-DE圖譜Master膠進行統(tǒng)計，匹配的蛋白點較多集中在66.2-26.6kD，占總蛋白點數的68％，pH4.5～6之間，占總蛋白點數的83％。PDQuest

7、圖像軟件分析表明，有38個表達量差異在2倍以上蛋白點，其中18個差異蛋白呈下調表達，7個蛋白呈上調表達，13個蛋白先下調然后上調表達。MALDI-TOF-TOF/MS鑒定結果表明，有31個蛋白點被成功鑒定(鑒定率為81.58％)，可以分為6個功能類群，包括分泌和調節(jié)蛋白(15.79％)，抗氧化作用相關的蛋白(20.05％)，氮代謝相關的蛋白(10.53％)，能量和糖代謝相關的酶(10.53％)，細胞分裂相關蛋白(2.63％)，未知蛋白(

8、21.05％)等，另有7個蛋白點未鑒定成功(18.42％)。這些差異蛋白在發(fā)菜的生長發(fā)育和抗逆作用有中具有重要功能。
　　 3干燥和恢復吸水發(fā)菜超微結構、生理和蛋白質組學分析
　　 在發(fā)菜持續(xù)失水48 h，然后恢復吸水4 h條件下，形態(tài)和結構分析表明，持續(xù)失水48h(48HAD)的發(fā)菜外表干燥、鄒縮，呈黑色，但藻體、藻絲體、膠鞘和細胞結構完整，類囊體膜及細胞內顆粒物質無明顯變化，恢復吸水4 h后，藻體膨脹、呈藍綠色或棕褐

9、色，具有光澤，藻體、藻絲體、膠鞘和細胞結構完整，但細胞內液泡的數量和體積比干燥發(fā)菜細胞的要多；生理學分析表明，恢復吸水4 h后的發(fā)菜自由水含量、自由水/束縛水比值、凈光合活性、暗呼吸速率、RuBisCO活性、可溶性糖、O2、SOD、CAT、POD、固氮酶和谷氨酰胺合成酶活性顯著增加，而MDA、H2O2、氨、脯氨酸、谷氨酸鹽含量明顯下降；比較蛋白質組學研究表明，與失水-復吸水密切相關的32個蛋白被鑒定，包括分泌蛋白(2.38％)、信號轉導

10、(2.38％)、轉錄和翻譯(4.76％)、抗氧化過程(11.90％)、氮代謝(9.52％)、碳和能量代謝(11.90％)、脂代謝(2.38％)、分子伴侶(4.76％)、未知蛋白(28.57％)和沒有鑒定成功蛋白(21.43％)?；谛螒B(tài)結構、生理和蛋白質組學分析，表明隨著干燥失水和恢復吸水，發(fā)菜的生長發(fā)育呈現靜止休眠與復蘇生長交替進行，在干燥條件下，生理代謝減弱，生長緩慢甚至停止，而當恢復吸水，代謝水平上調，生理活性增強，生長啟動甚至加

11、速。形態(tài)結構、生理和蛋白質組分的變化體現了發(fā)菜對特殊生態(tài)環(huán)境的適應。
　　 4發(fā)菜生長與耐旱相關差異蛋白基因克隆與原核表達
　　 通過分析發(fā)菜過氧化物氧還蛋白(Peroxiredoxin)、錳過氧化氫酶(Mn-CAT)、鐵氧還蛋白(Ferritin)和Hypothetical protein NXL-01在不同生長狀態(tài)及持續(xù)干燥48 h和復吸水4 h后的差異表達水平，根據鑒定的已知氨基酸序列設計簡并性引物克隆基因并進行生

12、物信息學分析，研究克隆基因的原核表達和分子驗證。結果表明：
　　 (1)根據簡并性引物克隆獲得長度為639 bp的過氧化物氧還蛋白基因，GenBank登陸號為BankIt1373957(HM854286)；693 bp的錳過氧化氫酶基因，GenBank登陸號為BankIt1311043(GU549477)；540 bp的鐵氧還蛋白基因，GenBank登陸號為BanIt1373981(HM854287)；327 bp的Hypoth

13、etical protein NXL-01基因，GenBank登陸號為BankIt1374705(HM854288)。
　　 (2)生物信息學分析表明：
　　 ①過氧化物氧還蛋白、錳過氧化氫酶、鐵氧還蛋白和Hypothetical protein NXL-01序列比較分析顯示該基因具有較高的保守性。
　　 ②過氧化物氧還蛋白在第194的Pro親水性最強，第122位的Arg疏水性最強；錳過氧化氫酶在第206的Gly

14、親水性最強，第96位的Val疏水性最強；鐵氧還蛋白在第128的Asp和129位的Glu親水性最強，第28位的Tyr疏水性最強；Hypothetical protein NXL-01在第101位的Glu親水性最強，第12位的Gly疏水性最強。
　　 ③過氧化物氧還蛋白二級結構主要由α螺旋、β折疊和隨機卷曲構成；錳過氧化氫酶二級結構主要由α螺旋、β折疊和隨機卷曲構成；鐵氧還蛋白二級結構主要由α螺旋和隨機卷曲構成；Hypothetic

15、al protein NXL-01二級結構主要由α螺旋和隨機卷曲構成。
　　 ④蛋白跨膜區(qū)分析表明過氧化物氧還蛋白、錳過氧化氫酶、鐵氧還蛋白和Hypotheticalprotein NXL-01為膜外蛋白。
　　 ⑤過氧化物氧還蛋白的Ser有5個磷酸化位點，Thr有6個磷酸化位點，Tyr有2個磷酸化位點；錳過氧化氫酶的Ser有3個磷酸化位點，Thr有1個磷酸化位點，Tyr有2個磷酸化位點；鐵氧還蛋白的Ser有1個磷酸化位

16、點，Thr有2個磷酸化位點，Tyr有1個磷酸化位點；Hypotheticalprotein NXL-01的Ser有5個磷酸化位點，Thr有1個磷酸化位點。
　　 (3)將過氧化物氧還蛋白、錳過氧化氫酶、鐵氧還蛋白和Hypothetical protein NXL-01基因在大腸桿菌中表達，分別獲得一個約26.5 kD、26 kD、22.4 kD和12.4 kD的外源蛋白。
　　 (4)對過氧化物氧還蛋白和錳過氧化氫酶基因

17、在大腸桿菌中表達的蛋白進行Westernblotting驗證，表明外源蛋白為過氧化物氧還蛋白和錳過氧化氫酶。
　　 (5)RT-PCR分析表明，在日生長周期的不同狀態(tài)下，錳過氧化氫酶基因、過氧化物氧還蛋白基因和鐵氧還蛋白基因在轉錄和翻譯水平上具有同樣表達差異，而均Hypothetical protein NXL-01基因在轉錄水平上無明顯差異；在干燥和復吸水狀態(tài)下，過氧化物氧還蛋白基因、錳過氧化氫酶基因、鐵氧還蛋白基因和Hypo