檉柳冷適應(yīng)蛋白（CAP）基因的功能驗(yàn)證.pdf

1、本研究將從極度抗旱、耐鹽、抗寒木本植物檉柳(Tamarix androssowii)中克隆得到的冷適應(yīng)蛋白(cold acclimation protein，cap)基因，構(gòu)建到酵母表達(dá)載體pYES2和植物表達(dá)載體pROK Ⅱ中，進(jìn)一步在真核細(xì)胞中驗(yàn)證cap基因的功能。 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： (1)將cap基因與酵母表達(dá)載體pYES2連接，獲得了pYES2-cap重組質(zhì)粒。將 pYES2-cap轉(zhuǎn)化酵母菌INVScl。隨機(jī)

2、挑選10個(gè)INVScl(pYES2-cap)單菌落，經(jīng)PCR檢測(cè)證明cap基因已構(gòu)建到pYES2載體上。對(duì)1NVScl(pYES2-cap)和INVScl(pYES2)菌株進(jìn)行誘導(dǎo)，研究外源基因在酵母中的的表達(dá)情況。Northern雜交結(jié)果表明，cap基因已經(jīng)在重組酵母INVScl(pYES2-cap)中表達(dá)。 (2)重組酵母INVScl(pYES2-cap)的NaCI、Na<,2>CO<,3>、NaHCO<,3>、干旱、紫外線

3、等脅迫，實(shí)驗(yàn)表明，INVScl(pYES2-cap)酵母的抗逆性明顯高于對(duì)照INVScl(pYES2)菌株，說明在酵母受到逆境脅迫時(shí)，cap基因表達(dá)的冷適應(yīng)蛋白對(duì)酵母細(xì)胞起到了保護(hù)作用，同時(shí)也證實(shí)了檉柳的cap基因具有提高真核生物抗逆性的功能。 (3)對(duì)山新楊進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得卡那霉素抗性芽，從中隨機(jī)選出8個(gè)株系，進(jìn)行PCR和Southern斑點(diǎn)雜交，證明cap基因已整合到山新楊基因組中：進(jìn)一步對(duì)8個(gè)株系進(jìn)行RT-PCR和Nor

4、thern雜交檢測(cè)，結(jié)果表明外源基因能夠在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)。 (4)分別對(duì)7個(gè)轉(zhuǎn)基因山新楊移栽苗進(jìn)行了低溫脅迫試驗(yàn)，測(cè)定并分析了脅迫后葉綠素含量、相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛(MDA)含量，結(jié)果顯示，隨著低溫脅迫時(shí)間的加劇，非轉(zhuǎn)基因山新楊葉綠素含量明顯下降，脅迫1 d后轉(zhuǎn)基因山新楊葉綠素含量平均高于對(duì)照20.49％；在冷脅迫下，轉(zhuǎn)基因山新楊相對(duì)電導(dǎo)率平均值低于對(duì)照山新楊的33.88％；對(duì)照山新楊MDA含量為34.18 μmo L.g<'-1

5、>，而轉(zhuǎn)基因山新楊MDA含量大多在18.86～33.14 μmoL.g<'-1>左右，低于對(duì)照山新楊，上述指標(biāo)均說明cap基因的導(dǎo)入提高了山新楊的抗低溫能力。 (5)分別對(duì)8個(gè)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行了NaCl脅迫，分析逆境脅迫條件下轉(zhuǎn)基因山新楊與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ丈叫聴畹谋?MDA)含量、相對(duì)電導(dǎo)率等指標(biāo)的變化。結(jié)果表明，NaCl脅迫處理后，各株系的相對(duì)電導(dǎo)率、MDA含量都逐漸增大，各轉(zhuǎn)基因株系相對(duì)電導(dǎo)率平均值低于對(duì)照山新楊的15.3