水稻T-DNA插入突變體庫的構(gòu)建及控制水稻株高和花粉育性基因OsLIS-L1的分離與鑒定.pdf

1、水稻是世界上最重要的糧食作物之一，約有一半人口以其為主食，同時(shí)，水稻也被視為單子葉植物研究的模式植物。隨著人類對包括水稻在內(nèi)的多種植物基因組測序的完成，現(xiàn)在的生物研究已進(jìn)入到功能基因組時(shí)代，構(gòu)建水稻大型T-DNA插入突變體庫是在全基因組水平上研究基因功能的重要技術(shù)平臺。本研究參與構(gòu)建了水稻T-DNA插入突變體庫，創(chuàng)建了約60，000株獨(dú)立轉(zhuǎn)化子。
　　 株高是水稻的重要農(nóng)藝性狀之一，它與植株的豐產(chǎn)潛力，抗倒伏和肥料的耐久性密切相

2、關(guān)。20世紀(jì)60年代以矮化育種為標(biāo)志的“綠色革命”，使水稻產(chǎn)量有了前所未有的突破。自此以后，株高的遺傳基礎(chǔ)得到了廣泛研究。植物花藥的發(fā)育是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，包括了從花藥囊壁的發(fā)育、花粉母細(xì)胞的發(fā)育，到小孢子的產(chǎn)生、花粉粒的成熟，其中只要任何一個(gè)步驟出現(xiàn)不正常，最終都有可能影響整個(gè)植株的育性。此過程涉及諸多基因，研究這些基因在花藥發(fā)育過程中生理生化方面的功能，將有利于對花藥發(fā)育取得更深入的認(rèn)識，具有非常大的理論和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。本研究利用

3、本室水稻T-DNA插入突變體庫篩選了3.905個(gè)突變家系，得到134份初步共分離的突變家系和1個(gè)共分離家系，并分離鑒定了一個(gè)控制水稻株高和花粉育性的新基因OsLIS-L1，主要研究結(jié)果如下：
　　 1.創(chuàng)建獨(dú)立T-DNA轉(zhuǎn)化單株約60，000株。
　　 2.篩選3，905個(gè)突變家系，得到134份初步共分離的突變家系和1個(gè)共分離家系：03Z11AI23(本室陳志輝提供的初篩材料)。將03Z11AI23家系分離出的半矮和低育

4、性突變體命名為oslis-l1-1，且對oslis-l1-1進(jìn)行詳細(xì)的突變表型分析并分離克隆相應(yīng)基因OsLIS-L1。03Z11AI23家系的T1代及其T2代共分離檢測顯示：半矮和低育性的突變性狀與T-DNA純合插入完全共分離。
　　 3.從韓國POSTECH大學(xué)的突變體庫中得到等位突變體：3A-04974，命名為oslis-l1-2，突變性狀也是半矮和低育性，共分離檢測也是完全共分離。
　　 4.通過RNAi干涉技術(shù)抑

5、制野生型材料中內(nèi)源OsLIS-L1基因的表達(dá)，導(dǎo)致水稻的株高和育性顯著降低；而將OsLIS-L1轉(zhuǎn)入oslis-11-2突變體后，可以使株高和育性恢復(fù)，這充分證明了OsLIS-L1基因是控制水稻株高和花粉育性的基因。
　　 5.RT-PCR分析顯示：在兩個(gè)等位突變體中，由于T-DNA的插入產(chǎn)生2個(gè)不同的截?cái)嗟霓D(zhuǎn)錄本。
　　 6.花粉母細(xì)胞壓片染色觀察突變體的減數(shù)分裂過程，結(jié)果顯示：oslis-l1-2突變體和野生型在整個(gè)

6、減數(shù)分裂過程中沒有明顯的差異，說明低育性與花粉減數(shù)分裂過程無關(guān)。
　　 7.KI-I2溶液染色成熟花粉顯示：突變體的花粉粒幾乎全不著色，這表明突變體雄性不育。而用oslis-l1-2突變體花粉做母本，野生型花粉做父本，則雜交結(jié)實(shí)正常，表明突變體雌性育性基本正常。
　　 8.野生型和oslis-l1-2突變體花藥半薄切片結(jié)果顯示：相較于野生型花藥的發(fā)育，oslis-l1-2突變體花粉囊壁的發(fā)育正常，花粉母細(xì)胞及其隨后的小孢

7、子的發(fā)育也沒有明顯變化，但從花藥發(fā)育第十期(stage10)至成熟花粉時(shí)期，花粉粒皺褶、干癟，沒有活力。說明目的基因OsLIS-L1的失活產(chǎn)生大量不正常的花粉，導(dǎo)致低育性表型出現(xiàn)?；ㄋ幫干潆婄R(TEM)結(jié)果與花藥半薄切片結(jié)果一致，oslis-l1-2花藥囊壁的發(fā)育沒有受到影響，中間層和絨氈層細(xì)胞可以正常降解；并且花粉壁的發(fā)育也沒有受到影響。
　　 9.對野生型和oslis-l1-2突變體成熟期莖的不同節(jié)間長度進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)除了第

8、一節(jié)間長度有明顯差距外，其它節(jié)間長度均無明顯差距，然后采用半薄切片的方法來觀察野生型和oslis-l1-2突變體莖第一節(jié)間的細(xì)胞形態(tài)。半薄切片結(jié)果顯示：野生型和oslis-l1-2突變體莖第一節(jié)間的細(xì)胞層數(shù)和大小均無明顯差別，說明目的基因OsLIS-L1的失活引起莖第一節(jié)間細(xì)胞數(shù)目的減少，導(dǎo)致株高變矮。
　　 10.實(shí)時(shí)定量PCR分析顯示：抽穗期時(shí)OsLIS-L1基因在根、莖、葉、葉鞘和穗中都有不同程度的表達(dá)，但在莖和穗中表達(dá)量