殼聚糖抑制蜂花粉源菌群效果的熒光定量PCR檢測(cè).pdf

1、本文主要用常規(guī)PCR技術(shù)鑒定了蜂花粉源的致病菌種類,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了水溶性殼聚糖溶液抑菌前后蜂花粉源菌群的變化,同時(shí)還對(duì)油菜蜂花粉源的菌株特別是蜜蜂球囊菌的水溶性殼聚糖抑菌濃度進(jìn)行了研究。結(jié)果如下:
　　 (1)從油菜蜂花粉中分離得到真菌9株(F1-F9),細(xì)菌12株(B1-B12)。通過形態(tài)學(xué)鑒定,初步判定F1、F5為土曲霉菌株；F4為黑曲霉菌株；F2、F3、F6和F7為根霉菌株；F8為擬蜜蜂球囊菌菌株；F9為擬

2、黃曲霉菌菌株；B1-B12大多數(shù)為擬芽孢桿菌菌株。
　　 (2)根據(jù)形態(tài)學(xué)初步鑒定的結(jié)果,本試驗(yàn)選擇出6個(gè)菌種(芽孢桿菌、黃曲霉、土曲霉、根霉、黑曲霉和蜜蜂球囊菌),分別設(shè)計(jì)引物,進(jìn)行常規(guī)PCR技術(shù)鑒定。所得PCR產(chǎn)物測(cè)序后經(jīng)與NCBI比對(duì)表明:F1、F5為土曲霉；F4為黑曲霉；F2、F3、F6和F7為根霉；F8為蜜蜂球囊菌；F9為黃曲霉菌；B1-B12菌株中除B6和B8外,其他均為芽孢桿菌。
　　 (3)采用常規(guī)PCR

3、技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),分別檢測(cè)不同濃度水溶性殼聚糖對(duì)蜂花粉源6種菌群的抑制情況。結(jié)果表明:以混合菌株提取的DNA為模板進(jìn)行的常規(guī)PCR,其各自產(chǎn)物的電泳條帶亮度并不能給出其各自受到抑制前后的DNA總量的變化。由熒光定量PCR技術(shù)得到的CT值表明:水溶性殼聚糖對(duì)6種菌均有一定的抑制作用；隨著濃度增加,其抑制作用增強(qiáng)。
　　 (4)以不同濃度梯度的水溶性殼聚糖溶液,對(duì)蜂花粉源的真菌(菌株F1-F9)、細(xì)菌(菌株B1-B12)

4、進(jìn)行抑制試驗(yàn)。結(jié)果顯示:水溶性殼聚糖溶液對(duì)真菌的抑制效果較好。真菌中各個(gè)菌株對(duì)殼聚糖的耐力有所不同,由弱到強(qiáng)依次為(以抑制率達(dá)到50％以上時(shí)的殼聚糖濃度排序):F7和F8(大于0.02g／mL時(shí)),F1和F3(大于0.04g／mL時(shí)),F4(大于0.06g／mL時(shí))；F2、F6和F9有一定耐力,F5有較強(qiáng)耐力。細(xì)菌中各個(gè)菌株對(duì)殼聚糖的敏感性大不相同,由強(qiáng)到弱分別為(以殼聚糖的最小抑菌濃度MIC排序):B4(0.003125g／mL),B

5、2、B3、B5、B6、B10、B11和B12(0.00625g／mL),B8(0.0125g／mL),Bl、B7和B9(0.025g／mL)。
　　 (5)選取對(duì)殼聚糖耐力最弱的蜜蜂球囊菌(蜜蜂白堊病的主要致病菌)進(jìn)行進(jìn)一步的抑制試驗(yàn),結(jié)果顯示:培養(yǎng)48h后,濃度為0.04g／mL以上的平板內(nèi)不長(zhǎng)菌落,其抑制率為100％,濃度為0.04g／mL以下的菌落比對(duì)照組生長(zhǎng)緩慢。培養(yǎng)72h后,濃度為0.08g／mL以上的平板內(nèi)不長(zhǎng)菌落,