2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、紅豆杉細胞大規(guī)模培養(yǎng)是最有前景的解決紫杉醇藥源途徑之一。紅豆杉細胞培養(yǎng)過程中紫杉醇含量低而且極不穩(wěn)定在一定程度上限制其工業(yè)化生產。隨著紫杉醇生物合成途徑的闡明和關鍵酶及轉錄因子的克隆,使得通過利用基因工程方法構建高產轉基因細胞株成為可能。目前紅豆杉細胞遺傳轉化體系的研究相對較少,本文對根癌農桿菌介導的紅豆杉細胞遺傳轉化進行了系統研究,并獲得了系列轉基因的細胞株。主要結果如下:
   1)植物表達載體構建。首先從長春花和擬南芥中分

2、別克隆到ORCA3和DNA甲級轉移酶MET1基因,然后分別構建了ORCA3 植物表達載體和MET1-RNAi 干涉載體,并轉化到土壤農桿菌EHA105菌株中。
   2)對根癌農桿菌介導的紅豆杉細胞遺傳轉化體系進行優(yōu)化。
   對影響紅豆杉細胞遺傳轉化的主要因素,如菌液濃度、侵染時間、共培養(yǎng)溫度和時間等進行了優(yōu)化,得到最優(yōu)的轉化條件是:選用農桿菌菌株EHA105、以生長狀態(tài)良好的曼地亞紅豆杉懸浮培養(yǎng)細胞為受體材料、菌液光

3、密度OD600=0.6、侵染時間25min、共培養(yǎng)最適溫度21℃、共培養(yǎng)時間為48 h;最適的頭孢霉素抑菌濃度、潮霉素篩選濃度分別為300 mg/L和8 mg/L。最優(yōu)的除菌及篩選方式為:用含100mg/L 頭孢霉素的無菌水沖洗10 s 共培養(yǎng)結束的細胞材料,然后將材料轉至含300mg/L 頭孢霉素的抑菌培養(yǎng)基上,兩周后轉至含150 mg/L 卡那霉素或8 mg/L 潮霉素的篩選培養(yǎng)基上,篩選3個周期可獲得轉基因細胞株。
  

4、3)轉基因細胞株ORCA3基因表達分析。對篩選出的陽性細胞進行GUS組織化學活性染色、外源基因的PCR擴增檢測和western blot分析,結果表明,外源目的基因已經成功整合到紅豆杉基因組中,并在蛋白質水平得到表達;用HPLC 法檢測紫杉醇含量,發(fā)現轉基因細胞株紫杉醇含量變化趨勢并不相同,這可能是由插入位點的不同導致的。轉基因細胞株紫杉醇的最高含量為159.3 μg/g 干重,為對照組的2.5倍。
   4)轉基因細胞株MET

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