丹參遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建及SmGGPPS和SmKSL的轉(zhuǎn)基因研究.pdf

1、丹參(Salvia miltiorrhiza)是唇形科鼠尾草屬的多年生草本植物，具有較高的藥用價(jià)值，據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載丹參干燥的根和莖可入藥。丹參在東亞各國(guó)廣泛種植用于治療和預(yù)防心腦血管疾病、高血脂和急性缺血性中風(fēng)，其活性成分包括水溶性和脂溶性兩種。丹參在臨床上應(yīng)用廣泛使得需求量日益增加，人們開(kāi)始尋找新的途徑解決資源短缺。如今，通過(guò)次生代謝途徑上關(guān)鍵酶基因克隆和遺傳轉(zhuǎn)化研究，提高次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量逐漸成為藥用植物生物技術(shù)的研究熱點(diǎn)，

2、而建立高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系是基因工程研究的前提。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法作為丹參主要的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其條件逐漸被優(yōu)化。由于丹參毛狀根易培養(yǎng)、生長(zhǎng)周期短等優(yōu)越性，毛狀根遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化比較完善，而丹參植株遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化方面的研究較少。本研究通過(guò)篩選農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化過(guò)程中影響轉(zhuǎn)化效率的因素，最終建立起高效可靠的丹參植株遺傳轉(zhuǎn)化體系，為進(jìn)一步利用基因工程技術(shù)改良丹參品質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。
　　1.丹參遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建
　　以丹參葉片作為外植體，通過(guò)根

3、癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法將攜帶gus基因的pCAMBIA2301轉(zhuǎn)入丹參外植體中，初步建立起丹參的高效遺傳轉(zhuǎn)化體系。通過(guò)gus基因瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)，探究農(nóng)桿菌菌株類型、共培養(yǎng)時(shí)間、不同類型抗生素及濃度對(duì)丹參轉(zhuǎn)化率的影響。結(jié)果表明，以上因素都是農(nóng)桿菌介導(dǎo)丹參遺傳轉(zhuǎn)化的重要影響因子。優(yōu)化后的轉(zhuǎn)化方法是:將組培苗葉片剪成0.5 cm2，于1/2MS重懸液制備的ODλ600=0.6菌液中浸泡30 min，用無(wú)菌濾紙吸干菌液并接種于含1 mg/L6-

4、BA和0.5 mg/L2，4-D的MS共培養(yǎng)基上進(jìn)行3d共培養(yǎng)。共培養(yǎng)后的外植體用無(wú)菌水沖洗5遍，無(wú)菌濾紙吸干水后轉(zhuǎn)接到含1 mg/L6-BA、0.5 mg/L2，4-D、400 mg/L特美汀的MS除菌培養(yǎng)基上，除菌培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織和幼芽階段需添加50 mg/L卡那霉素進(jìn)行陽(yáng)性篩選。篩選出的幼芽接種到含0.2 mg/L IBA的1/2MS生根培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)生根和促進(jìn)植株生長(zhǎng)。
　　2.丹參過(guò)表達(dá)，mGGPPS和SmKSL的轉(zhuǎn)基因

5、研究
　　根據(jù)SmGGPPS和SmKSL的序列信息設(shè)計(jì)兩端引物，從丹參基因組中擴(kuò)增目的片段，連接至pMD19-T載體上。用XbaⅠ/SacⅠ對(duì)SmGGPPS進(jìn)行雙酶切，用BamHⅠ/SacⅠ對(duì)SmKSL進(jìn)行雙酶切，插入pCAMBIA2301植物表達(dá)載體，最終經(jīng)過(guò)酶切檢測(cè)和測(cè)序檢測(cè)確定目的片段整合到載體上。將含有目的基因的載體通過(guò)本研究構(gòu)建的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入植物體中，經(jīng)過(guò)篩選和PCR檢測(cè)獲得轉(zhuǎn)基因幼苗，煉苗后移栽于盆中，經(jīng)過(guò)一段