TRPV6在蛋雞不同組織的表達(dá)分布及其在蛋殼腺鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用.pdf

1、TRPV6是瞬時(shí)性受體電位通道TRP超家族中的成員.廣泛分布于哺乳動(dòng)物Ca2+大量轉(zhuǎn)運(yùn)組織:腸道、腎臟、胎盤(pán)、骨骼等.是專(zhuān)門(mén)的上皮樣通道,具有高度的Ca2+選擇性,承擔(dān)Ca2+向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的限速通道.但TRPV6在蛋雞上皮細(xì)胞Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)的重要作用還未曾報(bào)道,本文旨在研究TRPV6在蛋雞體內(nèi)的表達(dá)分布及其在蛋殼腺Ca2+轉(zhuǎn)移中的重要作用,進(jìn)而闡明產(chǎn)蛋期TRPV6在維持體內(nèi)鈣離子平衡的作用機(jī)制.
　　 試驗(yàn)Ⅰ鈣離子跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋

2、白基因在蛋雞不同腸段和腎臟中的表達(dá)
　　 10羽220日齡高產(chǎn)蛋雞,斷頸處死,采集不同腸段和腎臟組織.應(yīng)用RT-PCR方法分別從蛋雞不同腸段和腎臟組織擴(kuò)增得到雞TRPV6、CaBP-D28K和PMCA1b編碼基因,然后將特異性片段連接到pMD18-T載體,測(cè)序分析擴(kuò)增片段準(zhǔn)確性；同時(shí)應(yīng)用Real-time PCR方法檢測(cè)不同腸段和腎臟中三種蛋白編碼基因的表達(dá)量。結(jié)果表明:分別擴(kuò)增得到426 bp的TRPV6序列,789 bp的C

3、aBP-D28K序列以及644 bp的PMCA1b序列,測(cè)序結(jié)果與GeneBank報(bào)道的預(yù)測(cè)序列一致.另外,TRPV6 mRNA在十二指腸表達(dá)量最高,其次是空腸(P<0.05)、回腸(P<0.01)、盲腸(P<0.01)和直腸(P<0.01),腎臟表達(dá)量顯著低于十二指腸(P<0.05)；CaBP-D28K和PMCA1b mRNA在十二指腸、空腸、回腸段表達(dá)量較高,直腸和腎臟中表達(dá)量顯著降低(P<0.05).結(jié)果顯示:在蛋雞腸道和腎臟都存

4、在鈣離子跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白基因的表達(dá),并提示蛋雞腸道鈣離子轉(zhuǎn)移主要在小腸段完成；同時(shí),TRPV6基因的成功擴(kuò)增為深入研究蛋雞腸道鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制開(kāi)辟了廣闊的領(lǐng)域.
　　 試驗(yàn)Ⅱ TRPV6在蛋雞不同腸段和腎臟中的表達(dá)分布
　　 試驗(yàn)動(dòng)物同前.為探明TRPV6蛋白在蛋雞腸道和腎臟中的組織學(xué)分布特點(diǎn),采用石蠟切片、特異性的TRPV6抗體對(duì)高產(chǎn)蛋雞不同腸段和腎臟組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)方法研究,同時(shí)采用western-blot方法研

5、究TRPV6蛋白在這些部位的濃度變化.結(jié)果表明:在十二指腸、空腸、回腸、盲腸和直腸的刷狀緣絨毛上皮均有TRPV6陽(yáng)性表達(dá)分布,直腸陽(yáng)性表達(dá)較少,腸隱窩或杯狀細(xì)胞則偶有表達(dá)。在腎臟,TRPV6在近曲小管、遠(yuǎn)曲小管和連接小管均有陽(yáng)性表達(dá)。western-blot結(jié)果指出十二指腸TRPV6含量最高,直腸含量最低,其他腸段位于二者之間.腎臟TRPV6含量也低于十二指腸.結(jié)果顯示:TRPV6蛋白在蛋雞整個(gè)腸道和腎臟上皮具有陽(yáng)性表達(dá),表明鈣離子跨細(xì)

6、胞轉(zhuǎn)運(yùn)在蛋雞體內(nèi)腸道鈣離子吸收或腎臟重吸收都具有重要作用.
　　 試驗(yàn)Ⅲ TRPV6在蛋雞不同生殖器官組織中的表達(dá)
　　 試驗(yàn)動(dòng)物同前。觀察TRPV6在蛋雞卵巢、輸卵管膨大部、峽部以及子宮的表達(dá)分布,本試驗(yàn)采用RT-PCR和免疫組化技術(shù)進(jìn)行定性研究,同時(shí)采用Real-time PCR和western-blot方法觀察其定量表達(dá)變化。結(jié)果表明:卵巢TRPV6蛋白主要分布在卵泡細(xì)胞、顆粒細(xì)胞以及卵泡膜細(xì)胞；在膨大部、峽部以及

7、子宮主要分布在黏膜上皮的纖毛上皮頂端(面向管腔),在子宮黏膜上皮的基底層細(xì)胞也有少量分布；另外,與卵巢組織中TRPV6表達(dá)量相比,膨大部和峽部mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.05),膨大部TRPV6蛋白含量顯著降低(P<0.05),子宮組織中TRPV6 mRNA水平低于卵巢組織,但蛋白表達(dá)量高于后者,且統(tǒng)計(jì)學(xué)分析沒(méi)有顯著差異.結(jié)果顯示,TRPV6在卵巢、膨大部、峽部以及子宮位置均有表達(dá),提示TRPV6不僅參與卵泡的發(fā)育、成熟,對(duì)蛋白以及

8、蛋殼的形成也具有重要的意義.
　　 試驗(yàn)Ⅳ產(chǎn)蛋循環(huán)過(guò)程中TRPV6、CaBP-D28K和PMCA1b在蛋殼腺的動(dòng)態(tài)表達(dá)
　　 研究鈣離子跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)方式在蛋殼形成過(guò)程中的作用,本實(shí)驗(yàn)將40羽220日齡ISA蛋雞分為5組,于產(chǎn)蛋后0h、2h、4.5h、8h、16h斷頭處死,采集蛋雞蛋殼腺組織,運(yùn)用Real-time PCR和 western-blot方法檢測(cè)產(chǎn)蛋循環(huán)過(guò)程中 TRPV6、CaBP-D28K、PMCA1b mRN

9、A和蛋白濃度的動(dòng)態(tài)變化.結(jié)果表明:卵子未進(jìn)入蛋殼腺前(產(chǎn)蛋后0～4.5h),蛋殼腺內(nèi)TRPV6、CaBP-D28K和PMCA1b mRNA表達(dá)水平較低,隨后表達(dá)量逐漸升高,在蛋殼鈣化過(guò)程中達(dá)到最大值(產(chǎn)蛋后16 h),與0h相比,TRPV6和CaBP-D28KmRNA表達(dá)差異均極顯著(P<0.01)；另外,產(chǎn)蛋循環(huán)過(guò)程中,TRPV6、CaBP-D28K和PMCA1b蛋白濃度變化與mRNA變化一致,產(chǎn)蛋后16 h到達(dá)最大值,其中CaBP-

10、D28K蛋白濃度與0 h相比,差異顯著(P<0.05).結(jié)論:產(chǎn)蛋循環(huán)可調(diào)控蛋殼腺內(nèi) TRPV6、CaBP-D28K和PMCA1b的表達(dá),并提示鈣離子跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)途徑在蛋殼鈣化過(guò)程鈣離子進(jìn)入過(guò)程發(fā)揮重要作用。
　　 試驗(yàn)Ⅴ血漿鈣磷濃度及其相關(guān)激素水平在產(chǎn)蛋循環(huán)中的動(dòng)態(tài)變化
　　 40羽220日齡ISA蛋雞分為5組,詳細(xì)記錄產(chǎn)蛋間隔時(shí)間,分別于產(chǎn)蛋后0h、2h、4.5 h、8 h、16 h斷頭處死,采集血液,測(cè)定血漿總鈣、總

11、磷、甲狀旁腺激素、降鈣素、堿性磷酸酶和骨鈣素水平.結(jié)果表明:在產(chǎn)蛋循環(huán)過(guò)程,血漿總鈣、總磷濃度未發(fā)生顯著變化；血漿甲狀旁腺激素水平在產(chǎn)蛋后16 h蛋殼鈣化過(guò)程中達(dá)到最高水平,與產(chǎn)蛋后0h相比,差異顯著(P<0.05)；血漿降鈣素水平在產(chǎn)蛋后0h含量最高,后逐漸降低,在8 h達(dá)到最低點(diǎn)(P<0.05)；產(chǎn)蛋后8 h,血漿堿性磷酸酶活性達(dá)到最高,與0 h相比,差異顯著(P<0.05)；另外,血漿骨鈣素水平在產(chǎn)蛋后4.5 h到達(dá)最高,但差異不