新基因URG11在組織中的表達(dá)及其在肝癌發(fā)生中的作用.pdf

1、【背景】
　　肝細(xì)胞肝癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害國(guó)人的健康。流行病學(xué)和分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)乙型肝炎病毒（HBV）長(zhǎng)期慢性感染是導(dǎo)致肝細(xì)胞肝癌的一個(gè)主要原因，乙肝病毒X基因開(kāi)放讀框編碼的乙肝病毒X蛋白（HBx）在肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。HBx為HBV復(fù)制的必須條件。HBx具有反式轉(zhuǎn)錄激活功能，可以調(diào)節(jié)許多與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的分子的表達(dá)；HBx能結(jié)合并阻斷抑癌基因p53的功能；此外HBx還能調(diào)節(jié)胞漿中的多種調(diào)節(jié)

2、細(xì)胞增殖和分化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。然而，這些只能部分解釋HBx在肝癌中的作用。HBx促進(jìn)肝癌發(fā)生的機(jī)制未完全明了。為了進(jìn)一步尋找HBx發(fā)揮作用的其它分子，我們前期的工作運(yùn)用抑制消減雜交及全長(zhǎng)PCR擴(kuò)增技術(shù)（RACE-PCR）克隆出了一個(gè)可以被HBx蛋白上調(diào)新基因URG11（Upregulatedgene11），該基因定位在人的11號(hào)染色體長(zhǎng)臂，含有13個(gè)外顯子，編碼區(qū)為2022個(gè)堿基對(duì)，編碼約70KD的蛋白。對(duì)基因及蛋白結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，該基

3、因含有含有1個(gè)穿膜螺旋（Transmembranehelices:281-297）；5個(gè)VWFC結(jié)構(gòu)域和1個(gè)C-typelectin結(jié)構(gòu)域；末端還有眾多酪氨酸（Longtyrosinesintail），并可能有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)。VWFC結(jié)構(gòu)域廣泛存在生物界各種蛋白中，與細(xì)胞黏附、遷移、淋巴細(xì)胞的歸巢、及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)；C-typelectin結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞的增殖，分化及信號(hào)通路密切相關(guān)，提示URG11可能是細(xì)胞生長(zhǎng)的一個(gè)調(diào)節(jié)因子。進(jìn)一步研

4、究發(fā)現(xiàn)URG11在肝癌等惡性腫瘤中高表達(dá)，與腫瘤惡性程度相關(guān)；將其轉(zhuǎn)染入腫瘤細(xì)胞可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，還可上調(diào)Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵分子β-連接蛋白（β-catenin）的表達(dá)。但URG11在組織中的詳細(xì)表達(dá)分布及其促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的具體分子機(jī)制仍不明確，并且URG11與Wnt信號(hào)通路之間的關(guān)系也不清楚。
　　【目的】
　　1、檢測(cè)URG11在多種正常組織及腫瘤組織中的表達(dá)分布及意義。
　　2、檢測(cè)URG11在肝

5、癌組織及肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)及意義。
　　3、探討URG11與HBx在肝癌組織及細(xì)胞中表達(dá)之間的關(guān)系。
　　4、檢測(cè)URG11對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
　　5、探討URG11促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的可能機(jī)制。
　　【方法】
　　1、免疫組化檢測(cè)URG11在多種正常及腫瘤組織中的表達(dá)分布，并分析其表達(dá)差異。
　　2、免疫組化檢測(cè)URG11和HBx在肝癌、癌旁組織及正常肝組織中的表達(dá)分布，分析兩者在肝癌中表達(dá)的意義

6、及兩者表達(dá)之間的關(guān)系。
　　3、RT-PCR和Westernblot檢測(cè)肝癌細(xì)胞系（HHCC、HepG2和SMMC-7721）、永生化肝細(xì)胞QZG及轉(zhuǎn)染HBx基因的肝癌細(xì)胞中URG11的mRNA及蛋白的表達(dá)。
　　4、細(xì)胞組化檢測(cè)肝癌細(xì)胞中URG11的表達(dá)分布。
　　5、脂質(zhì)體法將URG11基因的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入QZG細(xì)胞，將URG11特異siRNA載體轉(zhuǎn)染入肝癌HHCC和HepG2細(xì)胞，G418篩選穩(wěn)定表達(dá)的單克隆。

7、
　　6、MTT法繪制轉(zhuǎn)染細(xì)胞及其對(duì)照細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。
　　7、流式細(xì)胞儀分析轉(zhuǎn)染細(xì)胞及其對(duì)照細(xì)胞的細(xì)胞周期分布及細(xì)胞凋亡。8、平板集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞的集落形成能力。
　　9、軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)及裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)URG11表達(dá)抑制后，肝癌細(xì)胞的體內(nèi)外成瘤能力的變化。
　　10、Westernblot和RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞周期相關(guān)分子p21waf1、cyclinD1、CDK4和CDK6

8、的變化。
　　11、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)URG11對(duì)Tcf/Lef信號(hào)的影響。
　　12、Westernblot檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞中GSK3β和β-catenin表達(dá)的變化。
　　【結(jié)果】
　　1、URG11在正常組織和腫瘤組織中的表達(dá)
　　免疫組化結(jié)果顯示URG11主要表達(dá)在胞漿中。在正常組織中，心、肺、脾、腎、腎上腺、膀胱、睪丸、子宮、肌肉、皮膚及胎盤(pán)組織中均可檢測(cè)到不同程度的URG11表達(dá)，

9、但在腦、胸腺、淋巴結(jié)、卵巢和前列腺組織中沒(méi)有檢測(cè)到URG11的表達(dá)；在腫瘤組織中，肺、腎、膀胱、甲狀腺、乳腺、睪丸、卵巢及前列腺腫瘤組織中可檢測(cè)到URG11的表達(dá)，但在腦、子宮、和皮膚腫瘤組織未檢測(cè)到URG11的表達(dá)。URG11在甲狀腺、乳腺、卵巢和前列腺腫瘤組織中的表達(dá)顯著高于其對(duì)應(yīng)的正常組織，在子宮和皮膚腫瘤組織中的表達(dá)顯著低于其對(duì)應(yīng)正常組織。在消化系統(tǒng)腫瘤及正常組織中，URG11在胃癌、結(jié)腸癌和胰腺癌組織中的表達(dá)顯著高于其在對(duì)應(yīng)正

10、常組織中的表達(dá)。
　　2、URG11在肝癌組織、癌旁組織和正常肝組織中的表達(dá)
　　URG11陽(yáng)性表達(dá)主要見(jiàn)于細(xì)胞質(zhì)。85例肝癌標(biāo)本組織中，53例URG11表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為62.35％；癌旁組織中59例URG11表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為69.41％，URG11主要表達(dá)在肝硬化組織中；在27例正常肝組織中，僅5例呈弱陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率18.5％。URG11在肝癌和癌旁肝硬化組織中的表達(dá)顯著高于正常組織。URG11在肝癌組織中的表達(dá)與肝

11、癌組織的分化程度顯著相關(guān)，高分化肝癌組織中URG11的表達(dá)顯著高于中分化和低分化肝癌組織，但URG11在中分化和低分化肝癌組織中的表達(dá)無(wú)顯著差異。在肝癌細(xì)胞系HHCC、HepG2和SMMC-7721中可檢測(cè)到不同程度的URG11mRNA及蛋白的表達(dá)，以HHCC中表達(dá)最高，但在正常肝細(xì)胞QZG中沒(méi)有檢測(cè)到URG11的表達(dá)。URG11在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)也高于正常肝細(xì)胞。
　　3、HBx在乙肝相關(guān)性肝癌和癌旁組織中的表達(dá)及與URG11

12、表達(dá)的關(guān)系
　　腫瘤細(xì)胞中HBx幾乎全部表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，偶見(jiàn)部分核染色。72例乙肝相關(guān)性肝癌標(biāo)本組織中，59例HBx陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率為81.9％；癌旁組織中HBx陽(yáng)性表達(dá)62例（86.1％），HBx也主要表達(dá)在肝硬化組織中；在27例正常組織中，沒(méi)有檢測(cè)到HBx的表達(dá)。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)在乙肝相關(guān)性肝癌組織中，HBx和URG11表達(dá)的相關(guān)系數(shù)為0.41（P<0.05），并且在肝癌癌旁組織中的相關(guān)系數(shù)為0.51（P<0.05）。HBx

13、基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞中，URG11mRNA和蛋白表達(dá)水平也增高。
　　4、URG11對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
　　將URG11正義載體轉(zhuǎn)染入QZG細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)QZG細(xì)胞生長(zhǎng)加快，細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期的細(xì)胞比例增加；將URG11-siRNA轉(zhuǎn)染入肝癌細(xì)胞HHCC和HepG2后，HHCC和HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)顯著減慢，錨定非依賴(lài)性生長(zhǎng)的能力、單細(xì)胞集落形成能力以及裸鼠體內(nèi)成瘤能力均顯著減弱，細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期比例顯著降低，但細(xì)

14、胞凋亡不發(fā)生明顯變化。
　　5、URG11對(duì)周期相關(guān)分子的影響
　　URG11表達(dá)上調(diào)后，周期相關(guān)分子cyclinD1、CDK4和CDK6表達(dá)被上調(diào)，p21waf1表達(dá)被抑制。URG11表達(dá)被抑制后，cyclinD1表達(dá)降低。
　　6、URG11對(duì)Wnt信號(hào)通路相關(guān)分子的影響
　　URG11表達(dá)升高后，β-catenin的表達(dá)增加，Tcf/Lef報(bào)告基因活性呈β-catenin依賴(lài)性的增強(qiáng)，cyclinD1表達(dá)也

15、呈β-catenin依賴(lài)性的增加；URG11表達(dá)抑制后，β-catenin的表達(dá)降低，cyclinD1表達(dá)也降低；GSK3β表達(dá)不受URG11表達(dá)改變的影響。
　　【結(jié)論】
　　1、在不同組織來(lái)源腫瘤的發(fā)生中，URG11可能起著不同的作用；URG11在腺體上皮組織來(lái)源的腫瘤發(fā)生過(guò)程中可能起著促進(jìn)作用，但在非腺體上皮組織來(lái)源的腫瘤發(fā)生過(guò)程中可能起著抑制作用。
　　2、URG11在肝癌的發(fā)生中起著重要的作用，其表達(dá)可能主要