新基因URG11在組織中的表達及其在肝癌發(fā)生中的作用.pdf

1、【背景】
　　肝細胞肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，嚴重危害國人的健康。流行病學和分子生物學研究發(fā)現(xiàn)乙型肝炎病毒（HBV）長期慢性感染是導致肝細胞肝癌的一個主要原因，乙肝病毒X基因開放讀框編碼的乙肝病毒X蛋白（HBx）在肝細胞肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。HBx為HBV復制的必須條件。HBx具有反式轉錄激活功能，可以調節(jié)許多與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關的分子的表達；HBx能結合并阻斷抑癌基因p53的功能；此外HBx還能調節(jié)胞漿中的多種調節(jié)

2、細胞增殖和分化的信號轉導途徑。然而，這些只能部分解釋HBx在肝癌中的作用。HBx促進肝癌發(fā)生的機制未完全明了。為了進一步尋找HBx發(fā)揮作用的其它分子，我們前期的工作運用抑制消減雜交及全長PCR擴增技術（RACE-PCR）克隆出了一個可以被HBx蛋白上調新基因URG11（Upregulatedgene11），該基因定位在人的11號染色體長臂，含有13個外顯子，編碼區(qū)為2022個堿基對，編碼約70KD的蛋白。對基因及蛋白結構域分析發(fā)現(xiàn)，該基

3、因含有含有1個穿膜螺旋（Transmembranehelices:281-297）；5個VWFC結構域和1個C-typelectin結構域；末端還有眾多酪氨酸（Longtyrosinesintail），并可能有多個磷酸化位點。VWFC結構域廣泛存在生物界各種蛋白中，與細胞黏附、遷移、淋巴細胞的歸巢、及信號轉導密切相關；C-typelectin結構域和細胞的增殖，分化及信號通路密切相關，提示URG11可能是細胞生長的一個調節(jié)因子。進一步研

4、究發(fā)現(xiàn)URG11在肝癌等惡性腫瘤中高表達，與腫瘤惡性程度相關；將其轉染入腫瘤細胞可以促進腫瘤細胞的生長，還可上調Wnt信號轉導通路中的關鍵分子β-連接蛋白（β-catenin）的表達。但URG11在組織中的詳細表達分布及其促進腫瘤細胞生長的具體分子機制仍不明確，并且URG11與Wnt信號通路之間的關系也不清楚。
　　【目的】
　　1、檢測URG11在多種正常組織及腫瘤組織中的表達分布及意義。
　　2、檢測URG11在肝

5、癌組織及肝癌細胞系中的表達及意義。
　　3、探討URG11與HBx在肝癌組織及細胞中表達之間的關系。
　　4、檢測URG11對肝癌細胞生長的影響。
　　5、探討URG11促進肝癌細胞生長的可能機制。
　　【方法】
　　1、免疫組化檢測URG11在多種正常及腫瘤組織中的表達分布，并分析其表達差異。
　　2、免疫組化檢測URG11和HBx在肝癌、癌旁組織及正常肝組織中的表達分布，分析兩者在肝癌中表達的意義

6、及兩者表達之間的關系。
　　3、RT-PCR和Westernblot檢測肝癌細胞系（HHCC、HepG2和SMMC-7721）、永生化肝細胞QZG及轉染HBx基因的肝癌細胞中URG11的mRNA及蛋白的表達。
　　4、細胞組化檢測肝癌細胞中URG11的表達分布。
　　5、脂質體法將URG11基因的真核表達載體轉入QZG細胞，將URG11特異siRNA載體轉染入肝癌HHCC和HepG2細胞，G418篩選穩(wěn)定表達的單克隆。

7、
　　6、MTT法繪制轉染細胞及其對照細胞的生長曲線。
　　7、流式細胞儀分析轉染細胞及其對照細胞的細胞周期分布及細胞凋亡。8、平板集落形成實驗檢測轉染細胞及對照細胞的集落形成能力。
　　9、軟瓊脂集落形成實驗及裸鼠成瘤實驗檢測URG11表達抑制后，肝癌細胞的體內外成瘤能力的變化。
　　10、Westernblot和RT-PCR檢測轉染細胞和對照細胞周期相關分子p21waf1、cyclinD1、CDK4和CDK6

8、的變化。
　　11、雙熒光素酶報告基因實驗檢測URG11對Tcf/Lef信號的影響。
　　12、Westernblot檢測轉染細胞和對照細胞中GSK3β和β-catenin表達的變化。
　　【結果】
　　1、URG11在正常組織和腫瘤組織中的表達
　　免疫組化結果顯示URG11主要表達在胞漿中。在正常組織中，心、肺、脾、腎、腎上腺、膀胱、睪丸、子宮、肌肉、皮膚及胎盤組織中均可檢測到不同程度的URG11表達，

9、但在腦、胸腺、淋巴結、卵巢和前列腺組織中沒有檢測到URG11的表達；在腫瘤組織中，肺、腎、膀胱、甲狀腺、乳腺、睪丸、卵巢及前列腺腫瘤組織中可檢測到URG11的表達，但在腦、子宮、和皮膚腫瘤組織未檢測到URG11的表達。URG11在甲狀腺、乳腺、卵巢和前列腺腫瘤組織中的表達顯著高于其對應的正常組織，在子宮和皮膚腫瘤組織中的表達顯著低于其對應正常組織。在消化系統(tǒng)腫瘤及正常組織中，URG11在胃癌、結腸癌和胰腺癌組織中的表達顯著高于其在對應正

10、常組織中的表達。
　　2、URG11在肝癌組織、癌旁組織和正常肝組織中的表達
　　URG11陽性表達主要見于細胞質。85例肝癌標本組織中，53例URG11表達陽性，陽性率為62.35％；癌旁組織中59例URG11表達陽性，陽性率為69.41％，URG11主要表達在肝硬化組織中；在27例正常肝組織中，僅5例呈弱陽性表達，陽性率18.5％。URG11在肝癌和癌旁肝硬化組織中的表達顯著高于正常組織。URG11在肝癌組織中的表達與肝

11、癌組織的分化程度顯著相關，高分化肝癌組織中URG11的表達顯著高于中分化和低分化肝癌組織，但URG11在中分化和低分化肝癌組織中的表達無顯著差異。在肝癌細胞系HHCC、HepG2和SMMC-7721中可檢測到不同程度的URG11mRNA及蛋白的表達，以HHCC中表達最高，但在正常肝細胞QZG中沒有檢測到URG11的表達。URG11在肝癌細胞系中的表達也高于正常肝細胞。
　　3、HBx在乙肝相關性肝癌和癌旁組織中的表達及與URG11

12、表達的關系
　　腫瘤細胞中HBx幾乎全部表達于細胞質中，偶見部分核染色。72例乙肝相關性肝癌標本組織中，59例HBx陽性表達，陽性表達率為81.9％；癌旁組織中HBx陽性表達62例（86.1％），HBx也主要表達在肝硬化組織中；在27例正常組織中，沒有檢測到HBx的表達。相關性分析發(fā)現(xiàn)在乙肝相關性肝癌組織中，HBx和URG11表達的相關系數(shù)為0.41（P<0.05），并且在肝癌癌旁組織中的相關系數(shù)為0.51（P<0.05）。HBx

13、基因穩(wěn)定轉染的HepG2細胞中，URG11mRNA和蛋白表達水平也增高。
　　4、URG11對細胞生長的影響
　　將URG11正義載體轉染入QZG細胞后，發(fā)現(xiàn)QZG細胞生長加快，細胞由G1期進入S期的細胞比例增加；將URG11-siRNA轉染入肝癌細胞HHCC和HepG2后，HHCC和HepG2細胞的生長顯著減慢，錨定非依賴性生長的能力、單細胞集落形成能力以及裸鼠體內成瘤能力均顯著減弱，細胞由G1期進入S期比例顯著降低，但細

14、胞凋亡不發(fā)生明顯變化。
　　5、URG11對周期相關分子的影響
　　URG11表達上調后，周期相關分子cyclinD1、CDK4和CDK6表達被上調，p21waf1表達被抑制。URG11表達被抑制后，cyclinD1表達降低。
　　6、URG11對Wnt信號通路相關分子的影響
　　URG11表達升高后，β-catenin的表達增加，Tcf/Lef報告基因活性呈β-catenin依賴性的增強，cyclinD1表達也

15、呈β-catenin依賴性的增加；URG11表達抑制后，β-catenin的表達降低，cyclinD1表達也降低；GSK3β表達不受URG11表達改變的影響。
　　【結論】
　　1、在不同組織來源腫瘤的發(fā)生中，URG11可能起著不同的作用；URG11在腺體上皮組織來源的腫瘤發(fā)生過程中可能起著促進作用，但在非腺體上皮組織來源的腫瘤發(fā)生過程中可能起著抑制作用。
　　2、URG11在肝癌的發(fā)生中起著重要的作用，其表達可能主要