雞恒定鏈活性片段和NDVF蛋白表位嵌合體的制備及鑒定.pdf

1、恒定鏈Ii(Invariantchain)是一種非多態(tài)性的Ⅱ型跨膜糖蛋白，由胞漿區(qū)、跨膜區(qū)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔區(qū)三部分組成。恒定鏈在脊椎動(dòng)物中作為MHCⅡ類(lèi)分子成熟的分子伴侶，在協(xié)助MHCⅡ分子遞呈抗原過(guò)程中起重要作用。恒定鏈基因?qū)賳慰截惢颍嬖诋悩?gòu)體形式。恒定鏈上有許多功能活性片段，如胞漿區(qū)的兩個(gè)亮氨酸基序具有內(nèi)體定位功能，跨膜區(qū)的序列參與膜的錨定和促進(jìn)三聚化的形成，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔區(qū)的CLIP能占居MHCⅡ類(lèi)分子的肽結(jié)合槽，阻止內(nèi)源性抗原肽的結(jié)合

2、。三聚化區(qū)形成三聚體與MHCⅡ類(lèi)分子結(jié)合，作為其裝配的支架，CLIP區(qū)前還有促進(jìn)抗原肽加載到肽結(jié)合槽的Ii-key基序。越來(lái)越多的研究證明Ii是一個(gè)多功能分子，如Ii與MHCⅠ類(lèi)分子，與新生兒Fcγ受體和與血管緊張素Ⅱ受體的相互作用被發(fā)現(xiàn)；除在免疫調(diào)節(jié)中的作用外，還在應(yīng)用研究中有所發(fā)現(xiàn)，如利用Ii的內(nèi)體定向作用作為抗原的載體，用優(yōu)勢(shì)的抗原表位置換Ii的CLIP區(qū)，利用外加CLIP來(lái)增強(qiáng)免疫應(yīng)答，利用Ii的抑制和Ii的沉默技術(shù)。目前有兩種

3、機(jī)制能解釋Ii調(diào)節(jié)抗原肽加載到MHCⅡ分子上的功能：首先，Ii被降解留下CLIP區(qū)結(jié)合在抗原肽結(jié)合槽中，DM再解離CLIP而與抗原肽交換；再次，在CLIP區(qū)上游有一段序列，與MHCⅡ分子上稱(chēng)為別構(gòu)位點(diǎn)的部位結(jié)合，使抗原肽結(jié)合槽保持開(kāi)放直到新抗原肽結(jié)合在抗原肽結(jié)合槽里，這段序列稱(chēng)為Ii-key；美國(guó)antigenexpress公司將Ii-key與抗原表位通過(guò)連接臂相連形成Ii-key嵌合肽疫苗與單獨(dú)用表位免疫獲得了顯著的免疫增強(qiáng)效果。

4、r>　　 新城疫病毒可引起禽類(lèi)發(fā)病，一旦染病會(huì)給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的損失。融合蛋白是NDV表面一種重要的囊膜蛋白，在NDV病毒免疫中扮演重要的角色，實(shí)驗(yàn)室成員已將NDVF48E9強(qiáng)毒株融合蛋白上三個(gè)潛在的抗原表位串聯(lián)成F306，其免疫原性得到增強(qiáng)，但多肽疫苗的應(yīng)用受到MHC限制性，抗原性弱，表位置換難，持續(xù)時(shí)間短等限制，有必要對(duì)F306進(jìn)行改造。
　　 隨著雞，鴨，鵝，鵪鶉等禽類(lèi)Ii基因的克隆，通過(guò)序列比對(duì)在Ii中發(fā)現(xiàn)了一些保守序

5、列，如與鼠和人Ii-key(LRMK)相似的序列(LQRK)，我們稱(chēng)為禽類(lèi)Ii-key；為研究禽類(lèi)Ii-key(LQRK)是否具有免疫增強(qiáng)作用，以及雞恒定鏈的其它片段的功能，我們用恒定鏈上部分片段對(duì)取自新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F蛋白)的串聯(lián)表位F306進(jìn)行修飾，為進(jìn)一步比較經(jīng)雞恒定鏈部分功能片段修飾的表位與未經(jīng)修飾表位免疫效果奠定基礎(chǔ)。首先，將雞Ii-key的四肽(LQRK)、二肽(AP)的DNA序列設(shè)計(jì)到引物上，以pGEX-4T

6、-1/F306為模板，PCR擴(kuò)增獲Ii-key/F306、Ii-key/F306/AP片段，插入到質(zhì)粒pET-32a，而得pET-32a/Ii-key/F306、pET-32a/Ii-key/F306/AP重組質(zhì)粒。應(yīng)用添加互補(bǔ)性酶切位點(diǎn)的基因工程方法，使胞漿區(qū)(Cyt)前19個(gè)氨基酸片段與Ii-key/F306、Ii-key/F306/AP拼接，得到pET-32a/Cyt/Ii-key/F306、pET-32a/Cyt/Ii-key/