匣子青枯病拮抗菌Bacillus amyloliquefaciens S20的篩選鑒定及其拮抗物質(zhì)的研究.pdf

1、茄子青枯病是由茄科勞爾氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的細(xì)菌性土傳病害,是茄子的主要病害之一,威脅著我國(guó)茄子的生產(chǎn)。由于常規(guī)防治方法存在種種弊端,根際細(xì)菌介導(dǎo)的生物防治正成為備受人們關(guān)注的一種有效方法。本試驗(yàn)對(duì)茄子青枯病高效拮抗菌進(jìn)行了篩選、鑒定,通過(guò)PCR的方法對(duì)其含有的抗生素合成基因進(jìn)行了檢測(cè),對(duì)產(chǎn)拮抗物質(zhì)的條件、拮抗物質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行了初步研究,并利用高效液相色譜和液質(zhì)聯(lián)用對(duì)拮抗物質(zhì)進(jìn)行鑒定。研究結(jié)果分述如

2、下:
　　 (1)本試驗(yàn)共分離出40株形態(tài)不同的菌株,通過(guò)初篩、復(fù)篩得到具有明顯拮抗效果的6株菌,其中菌株S20的抑菌效果最好。通過(guò)盆栽試驗(yàn)表明拮抗菌S20對(duì)茄子青枯病的防治效果達(dá)到了68.6％。
　　 (2)通過(guò)形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)、16S rRNA基因同源性序列分析以及部分特異性基因序列分析,將菌株S20鑒定為解淀粉芽孢桿菌。
　　 (3)通過(guò)PCR方法發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌S20基因組中含有sfp、fenB、

3、bamA和ituA基因,它們分別是Surfactin、Fengycin、Bacillomycin和Iturin的生物合成相關(guān)基因。
　　 (4)解淀粉芽孢桿菌S20在NA培養(yǎng)基中產(chǎn)拮抗物質(zhì)的最佳條件為:培養(yǎng)時(shí)間84h、培養(yǎng)溫度30℃、轉(zhuǎn)速為170 r/min、初始pH7、裝液量為60 mL/250 mL。
　　 (5)從解淀粉芽孢桿菌S20的發(fā)酵液中提取的粗提物具有顯著抑制茄科勞爾氏菌的效果,并且具有良好的熱穩(wěn)定性,能耐

4、受100℃高溫；粗提物在pH2.0～9.0范圍內(nèi)保持拮抗活性的穩(wěn)定,而對(duì)強(qiáng)堿敏感；拮抗物質(zhì)對(duì)蛋白酶K和胃蛋白的作用表現(xiàn)出高的穩(wěn)定性,而胰蛋白酶能夠在一定條件下將拮抗物質(zhì)降解；拮抗物質(zhì)對(duì)紫外線穩(wěn)定。
　　 (6)菌株S20發(fā)酵液經(jīng)過(guò)酸沉淀、甲醇浸提等步驟得到脂肽類(lèi)化合物的粗提物。經(jīng)過(guò)高效液相色譜(HPLC)分離,發(fā)現(xiàn)了保留時(shí)間與Surfactin和Iturin A標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間基本一致的峰,初步確定粗提物中含有Surfactin

5、和Iturin A。按時(shí)間收集不同組分后檢測(cè)各組分的拮抗活性,結(jié)果表明2-4 min的組分有拮抗效果,而在此組分中含有保留時(shí)間與Iturin A基本一致的峰,所以推測(cè)Iturin A是主要的拮抗物質(zhì)。
　　 (7)粗提液經(jīng)HPLC-MS測(cè)定,證明分別含有Iturin、Fengycin和Surfactin三組抗菌活性物質(zhì)。經(jīng)ESI—MS/MS-CID技術(shù)分析,鑒定出第一組物質(zhì)為C13-C16的Iturin A；第二組物質(zhì)為C14-