番茄青枯病拮抗菌的篩選、鑒定和應(yīng)用研究.pdf

1、番茄青枯病是一類危害嚴(yán)重的世界性土傳細(xì)菌病害，它的有效防治已經(jīng)成為番茄生產(chǎn)中亟待解決的難題。本研究從生物防治的角度出發(fā)，分離篩選了對番茄青枯病有拮抗作用的菌株，通過溫室盆栽試驗和田間小區(qū)試驗進(jìn)行了防治效果和田間應(yīng)用效果評價。旨在為高效芽孢桿菌的研制和使用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。 主要研究內(nèi)容有以下幾個方面： 1.從山東壽光和蒼山不同種植年限的蔬菜大棚中分離得到的45株菌株以及中國農(nóng)業(yè)微生物菌庫中保存的19株菌株中，利用點(diǎn)

2、接法篩選到14株對茄科勞爾氏菌有拮抗作用的菌株，然后通過牛津杯法復(fù)篩得到6株抑菌效果較好的菌株。通過溫室盆栽試驗表明拮抗菌X10的防治效果最好，液體菌劑防治效果達(dá)到了81.8％，固體菌劑防治效果達(dá)到了65.4％。 2.對番茄青枯病拮抗菌X10進(jìn)行了形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征測定，結(jié)果表明它與側(cè)孢短芽孢桿菌種的特征一致。測定了菌株的16SrDNA序列并根據(jù)其構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，在系統(tǒng)發(fā)育樹中，X10與側(cè)孢短芽孢桿菌形成一個類群，序列同

3、源性為99％。因此將X10鑒定為側(cè)孢短芽孢桿菌(Brevibacilluslaterosporus)。 3.從側(cè)孢短芽孢桿菌X10發(fā)酵液中提取的拮抗蛋白粗提液具有抑制茄科勞爾氏菌生長的效果，該抗菌蛋白粗提液具有良好的熱穩(wěn)定性，能耐90℃的高溫；用蛋白酶處理，其抑菌活性受胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K的影響；對氯仿敏感；隨著紫外照射時間的延長，活性受到影響；拮抗物質(zhì)25℃保存，活性28d內(nèi)基本不變；作用活性pH(pH5.0～11.0

4、)范圍較寬，這對于芽孢桿菌用于生物肥料的生產(chǎn)和保藏具有一定的理論指導(dǎo)作用。 4.根據(jù)溫室盆栽試驗的結(jié)果，制備側(cè)孢短芽孢桿菌X10的固體菌劑，在山東萊陽趙旺莊鄉(xiāng)露地蔬菜栽培區(qū)和山東肥城科技示范園的蔬菜大棚里進(jìn)行了小區(qū)試驗，對田間應(yīng)用效果進(jìn)行了測定。結(jié)果表明固體菌劑的兩種接種量對番茄青枯病的防治效果分別達(dá)到了58.42％和68.68％，固體菌劑蔬菜大棚施用能夠促進(jìn)番茄植株生長和增加產(chǎn)量。 5.提取了側(cè)孢短芽孢桿菌X10的基因

5、組DNA，以綠色熒光蛋白(GFP)為報告基因，以啟動子探針pUC19-GFP為載體，通過鳥槍法在大腸桿菌DH5a中構(gòu)建了X10的啟動子文庫。通過篩選獲得了14個陽性克隆，編號為P1～P14。對P2、P3、P6、P9、P10、P13和P14克隆中的重組質(zhì)粒的插入片段進(jìn)行了測序和在線啟動子預(yù)測。結(jié)果顯示插入片段Ps3和Ps6具有典型的原核啟動子的特征，其它五個插入片段則沒有典型的原核啟動子特征。將Ps6插入到穿梭載體pNW33N的多克隆位點(diǎn)