VSV及其突變體的致病性的研究及M蛋白抗體檢測(cè)試劑盒的研制.pdf

1、水泡性口炎被國際獸醫(yī)局(OIE)列為A類傳染病，我國則屬二類進(jìn)境動(dòng)物傳染病。該病由水泡性口炎病毒(VSV)引起。VSV基因組編碼5個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，其中基質(zhì)蛋白(M)是其重要毒力因子，可阻遏宿主細(xì)胞mRNA由胞核向細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，并抑制感染病毒的細(xì)胞產(chǎn)生Ⅰ型干擾素IFNα/β，因此病毒得以快速繁殖。囊膜蛋白(G)是VSV另一重要的致病因子，在VSV出芽和包裝時(shí)起重要作用。同時(shí)，VSV病毒是一種有前途的溶瘤病毒和疫苗載體，它具有裂解小鼠腫瘤細(xì)胞的

2、能力，且其本身為RNA病毒，病毒基因組不會(huì)整合到宿主基因組內(nèi)，并對(duì)人無致病性。但當(dāng)VSV滴度較高時(shí)，會(huì)引起小鼠的神經(jīng)性癥狀，因此VSV的安全性有待進(jìn)一步的探索。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過比較VSV野生型、VSV△M51和VSV△M51-G△28突變株的形成空斑的能力與大小，病毒多步生長曲線與動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)，以了解兩個(gè)突變株的生物性狀的變化，以及在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中的弱化情況，并通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明:弱化是由于宿主細(xì)胞Ⅰ型干擾素作用和病毒復(fù)制能力

3、減低共同作用所致。
　　 本文克隆了印第安那型VSV的M基因，利用在大腸桿菌蛋白表達(dá)系統(tǒng)中制備的重組M蛋白建立了特異檢測(cè)M蛋白抗體的間接ELISA方法，以此為基礎(chǔ)，研究了感染VSV小鼠體內(nèi)M蛋白抗體的變化規(guī)律。通過表達(dá)并純化M蛋白為制各多克隆抗體和單克隆抗體提供便利。
　　 本研究的主要結(jié)果如下:
　　 1.在缺乏Ⅰ型干擾素信號(hào)的Vero細(xì)胞中，VSV和VSV△M51形成的空斑面積無顯著差異，且都顯著大于VSV△

4、M51-G△28;而在具備Ⅰ型干擾素信號(hào)的A549細(xì)胞中，VSV空斑面積顯著大于VSV△M51，VSV△M51-G△28較前兩者更弱。結(jié)果表明，VSV△M51-G△28在M和G蛋白雙突變共同作用下較M蛋白單突變的VSV△M51弱化效果更明顯。
　　 2.在PC3細(xì)胞中進(jìn)行多步生長曲線實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，病毒最高滴度比較為:VSV＞VSV△M51＞VSV△M51-G△28。VSV峰值在48h出現(xiàn)，而VSV△M51的滴度峰值在24h，到72h

5、后下降;VSV△M51-G△28變化趨勢(shì)與前者相似但下降更為明顯。在IFNβ表達(dá)水平上呈現(xiàn)VSV＜VSV△M51-G△28＜VSV△M51的特點(diǎn)。結(jié)果表明:VSV△M51-G△28的弱化受到了Ⅰ型干擾和病毒復(fù)制包裝能力弱化雙重因素共同制約。
　　 3.在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，VSV與VSV△M51組較PBS組體重下降明顯，且VSV組在第1d時(shí)體重開始下降，至第6d時(shí)達(dá)到最低下降約30％，部分小鼠出現(xiàn)神經(jīng)癥狀;VSV△M51組癥狀相似，但第

6、8-9d時(shí)體重降到30％左右并伴隨毛雜亂的癥狀:VSV△M51-G△28組無明顯病癥，體重在接種后穩(wěn)定上升，與PBS組相似。結(jié)果說明，VSV△M51-G△28突變體較其他兩種病毒致病力明顯下降。
　　 4.根據(jù)M基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，以pVSV質(zhì)粒為模板，克隆出690bp的特異條帶，并連接到pET32a(+)質(zhì)粒上，獲得重組質(zhì)粒，表達(dá)M蛋白并純化，并用SDS-PAGE及Western-blotting驗(yàn)證該重組蛋白活性。結(jié)果表明

7、，成功獲得重組質(zhì)粒及有生物學(xué)活性的重組M蛋白。
　　 5.以重組M蛋白為抗原建立ELISA檢測(cè)方法，通過方陣滴定優(yōu)化蛋白最佳包被濃度為12μg/ml和一抗稀釋度為1∶5000。
　　 6.在抗VSV M抗體的消長規(guī)律及體重變化的實(shí)驗(yàn)中表明，VSV感染可激發(fā)小鼠產(chǎn)生M蛋白抗體。當(dāng)接種劑量為106PFU時(shí)，M蛋白抗體在接種后第一周變化不明顯，而在第二周后開始顯著上升，同時(shí)伴隨著小鼠體重在接種后第一周非常顯著的下降，而在第二周