伏馬菌素B1免疫學(xué)快速檢測(cè)方法的研究.pdf

1、目前真菌毒素已經(jīng)成為食品中重要的污染源之一，其中伏馬菌素（Fumonisins，F(xiàn)）是污染較為嚴(yán)重的真菌毒素之一，它是一組主要由串珠鐮刀菌、多育鐮刀菌等鐮刀菌在一定條件下繁殖所產(chǎn)生的代謝毒物，其主要成分為伏馬菌素B1（FB1），并且大多存在于糧食和飼料中。伏馬菌素不僅具有肝腎毒性和肺毒性，而且具有神經(jīng)毒性、免疫系統(tǒng)毒性和致癌性等強(qiáng)烈毒性，因此糧食及其制品中伏馬菌素的污染會(huì)對(duì)畜牧業(yè)的健康發(fā)展以及人類(lèi)的身體健康造成嚴(yán)重的威脅。目前常用于檢測(cè)

2、伏馬菌素B1的方法有薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等，但這些方法都具有很多缺點(diǎn)，如需要對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜的前處理過(guò)程、需要價(jià)格高昂儀器設(shè)備、需要消耗大量時(shí)間、需要大量的人力物力等等，因此建立針對(duì)伏馬菌素的免疫學(xué)快速檢測(cè)方法就顯得尤為重要。本研究在制備伏馬菌素B1人工抗原的基礎(chǔ)之上，通過(guò)單克隆抗體技術(shù)篩選出了抗伏馬菌素B1的單克隆抗體，建立了伏馬菌素B1的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法，制備了檢測(cè)伏馬菌素B1的間接競(jìng)

3、爭(zhēng)ELISA快速檢測(cè)試劑盒。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴采用碳二亞胺（EDC）法將FB1與載體蛋白偶聯(lián)合成了人工抗原，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳鑒定，偶聯(lián)蛋白的遷移速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于載體蛋白，說(shuō)明偶聯(lián)成功，然后用免疫抗原免疫小鼠，成功制備了效價(jià)高達(dá)1:5.12×104、半數(shù)抑制濃度IC50為61.3ng/mL的FB1多克隆抗血清。⑵在成功制備伏馬菌素 B1人工抗原并且制備出敏感性好，特異性強(qiáng)的鼠源多克隆抗血清的基礎(chǔ)之上，通過(guò)單克隆抗體

4、技術(shù)成功地進(jìn)行了小鼠脾細(xì)胞與 NS0骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞融合，利用間接 ELISA方法和間接競(jìng)爭(zhēng) ELISA方法篩選出了1G11和2G12兩株能夠產(chǎn)生 FB1mAb的雜交瘤細(xì)胞株，它們的細(xì)胞上清效價(jià)為1:2.56×104和1:1.28×104。將1G11雜交瘤細(xì)胞通過(guò)腹腔注射到腹部有石蠟的小鼠體內(nèi)，使雜交瘤細(xì)胞在小鼠體內(nèi)大量增殖，并分泌特定的單克隆抗體，采集的腹水效價(jià)可以達(dá)到1:5.12×105。經(jīng)鑒定，該單克隆抗體的亞型為IgG1型，親和

5、常數(shù) Ka為2.7×1010L/mol，對(duì)伏馬菌素B1的半數(shù)抑制濃度IC50可以達(dá)到6.56ng/mL，并且與其他毒素競(jìng)爭(zhēng)物的交叉反應(yīng)率均低于1％。表明試驗(yàn)獲得了效價(jià)、敏感性、特異性和親和力都較為顯著的FB1mAb。⑶通過(guò)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法確定了抗原包被濃度為1:1000稀釋，抗體工作濃度為1:30000稀釋，建立了間接競(jìng)爭(zhēng) ELISA檢測(cè)方法，并且制備了伏馬菌素 B1間接競(jìng)爭(zhēng) ELISA快速檢測(cè)試劑盒。試劑盒的各項(xiàng)性能良好，其中標(biāo)