Bt毒素寡聚體形成與脂筏的關(guān)系以及鈣粘蛋白的免疫檢測技術(shù)探索.pdf

1、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)是一類革蘭氏陽性昆蟲病原細(xì)菌，芽孢形成期其能產(chǎn)生具有特異毒性的殺蟲晶體蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs)。Cry1Ac毒素是蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生的一種殺蟲晶體蛋白，它能夠在中腸上皮細(xì)胞形成孔洞，最終導(dǎo)致細(xì)胞腫脹破裂而死亡。脂筏是刷狀緣膜囊泡脂雙層內(nèi)一個特殊的微區(qū)結(jié)構(gòu)，此區(qū)域富含膽固醇、鞘脂類和糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨固蛋白，

2、是細(xì)胞生物學(xué)活動的平臺，在很多生物學(xué)活動中都起到十分重要的作用。CrylAc活化毒素單體和昆蟲中腸上皮細(xì)胞刷狀緣膜囊泡(BBMV)在37℃條件下孵育1h能夠形成250kDa的Cry1Ac毒素寡聚體結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)是昆蟲膜穿孔的致死關(guān)鍵。而毒素寡聚體的形成是由于Cry1Ac毒素單體與BBMV上鈣粘素受體的交互作用而形成的，之后形成的寡聚體再在氨肽酶受體的作用下與GPI-錨固蛋白結(jié)合，最終在GPI-錨固蛋白的作用下在細(xì)胞膜上形成穿孔導(dǎo)致細(xì)胞腫脹

3、最終死亡。
　　 脂筏是BBMV上的特殊微區(qū)，離體BBMV與離體脂筏是否都能通過與Cry1Ac毒素單體孵育而形成寡聚體結(jié)構(gòu)，本實(shí)驗(yàn)針對這一點(diǎn)重點(diǎn)進(jìn)行了研究。Bt毒素對敏感和抗性棉鈴蟲品系的作用方式是否相同，抗性品系是否能形成寡聚體，不同鱗翅目昆蟲形成寡聚體機(jī)制是否相同，這些是我們所要研究的主要問題。我們通過對棉鈴蟲敏感品系和抗性品系，菜青蟲，二化螟，斜紋夜蛾這五種鱗翅目昆蟲的研究來探討這一問題，我們采用Western-blott

4、ing試驗(yàn)方法證明：Cry1Ac毒素寡聚體的形成與離體脂筏結(jié)構(gòu)沒有直接關(guān)聯(lián)，離體條件下Cry1Ac毒素只能與BBMV孵育才能形成寡聚體結(jié)構(gòu)，但脂筏結(jié)構(gòu)必須保持其完整性。本試驗(yàn)通過使用膽固醇抑制劑甲基-β-環(huán)糊精和皂苷處理BBMV，離心從而去掉脂筏中的膽固醇，之后BBMV與Cry1Ac毒素孵育則寡聚體不能形成，說明脂筏完整性被破壞后不能行使其生物學(xué)功能；同時本實(shí)驗(yàn)還證實(shí)脂筏微區(qū)上GPI-錨固蛋白也是寡聚體形成的一個關(guān)鍵因素，PIPLC能夠

5、去除GPI錨固結(jié)構(gòu)，用PIPLC處理BBMV使其去掉GPI-錨固蛋白后，寡聚體也不能形成。
　　 試驗(yàn)中我們還分別采用Dot-blotting, ELISA的方法檢測棉鈴蟲抗性和敏感品系，二化螟，斜紋夜蛾中的鈣粘蛋白。應(yīng)用Dot-blotting和ELISA方法檢測分別從定性和定量的角度對鈣粘蛋白在昆蟲中腸的存在情況進(jìn)行分析，目的是探測一種田間抗性檢測的簡便方法。在Dot-blotting檢測中，田間采集各單頭棉鈴蟲之間并無明顯