石斑魚(yú)虹彩病毒dUTPase及兩個(gè)囊膜蛋白的鑒定和功能初步分析.pdf

1、新加坡石斑魚(yú)虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus，SGIV)是從養(yǎng)殖的石斑魚(yú)中分離到的水產(chǎn)動(dòng)物重要病毒病原。已經(jīng)對(duì)病毒的理化性質(zhì)，流行病學(xué)，全基因組信息等進(jìn)行了比較系統(tǒng)的研究。本文不僅建立了赤點(diǎn)石斑魚(yú)的腎組織細(xì)胞系，并在分子水平對(duì)SGIV編碼的dUTPase及兩個(gè)外膜蛋白進(jìn)行鑒定和功能初步分析，為研究病毒的致病機(jī)理提供技術(shù)平臺(tái)和理論依據(jù)。主要結(jié)果描述如下：
　　 1、采用組織消化法建立了赤點(diǎn)石斑魚(yú)腎

2、組織細(xì)胞系(EAGK)，通過(guò)顯微鏡觀察，細(xì)胞計(jì)數(shù)、染色體分型和細(xì)胞轉(zhuǎn)染等分析了傳代細(xì)胞系的特征。EAGK細(xì)胞可以在含10％FBS的L15培養(yǎng)基中保持良好的生長(zhǎng)趨勢(shì)，培養(yǎng)的適合溫度在25-30℃；染色體數(shù)目82條。細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證明，CMV和SV40啟動(dòng)子可以啟動(dòng)外源轉(zhuǎn)染基因在細(xì)胞內(nèi)的高效表達(dá)。此外，通過(guò)顯微和超微觀察、病毒滴度測(cè)定等方法證實(shí)EAGK細(xì)胞對(duì)SGIV敏感。以上結(jié)果揭示新建的EAGK細(xì)胞不僅能夠用于體外遺傳操作，而且可以用于水生

3、動(dòng)物病毒分離鑒定、病毒致病機(jī)理、功能基因及病毒與宿主相互作用的研究。
　　 2、通過(guò)同源性搜索和生物信息學(xué)分析表明：SGⅣ ORF049R編碼一個(gè)尿密啶脫氧核糖核苷三磷酸酶(dUTPase)；在其氨基酸序列近C-端存在一段核輸出信號(hào)(nuclear export signal，NES)。為深入研究SGⅣ編碼的dUTPase在病毒感染過(guò)程中的作用，對(duì)SGⅣ編碼的dUTPase基因進(jìn)行了克隆、表達(dá)、轉(zhuǎn)錄時(shí)序分析及亞細(xì)胞定位等特征分析

4、。RT-PCR和Western Blot的結(jié)果證實(shí)，該基因是一個(gè)病毒早期轉(zhuǎn)錄本，屬于立即早期基因。通過(guò)真核轉(zhuǎn)染和熒光顯微鏡觀察，顯示該酶是一個(gè)胞質(zhì)型蛋白，分布在細(xì)胞核外的胞質(zhì)區(qū)。同時(shí)，我們對(duì)NES片段進(jìn)行Overlapping PCR缺失，發(fā)現(xiàn)NES缺失后，SGⅣ dUTPase無(wú)法正常輸出細(xì)胞核，證明NES序列對(duì)SGⅣ dUTPase輸出細(xì)胞核起決定性作用。這是首次在dUTPase家族中發(fā)現(xiàn)NES介導(dǎo)的核輸出轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，將對(duì)進(jìn)一步了解病

5、毒基因在SGIV感染細(xì)胞中精細(xì)的亞細(xì)胞水平調(diào)控具有重要的指導(dǎo)意義。
　　 3、病毒的外囊膜蛋白在病毒感染、復(fù)制及致病過(guò)程中起重要作用。參照以往報(bào)道的分離囊膜蛋白的方法，我們改進(jìn)了一種新的分離SGⅣ外囊膜的方法。不僅可以方便快捷的分離病毒外囊膜和外膜蛋白，同時(shí)對(duì)病毒衣殼組分沒(méi)有明顯破壞。利用這種方法，我們分離了SGⅣ的兩個(gè)外囊膜蛋白：VP19和VP75。分別對(duì)兩個(gè)基因進(jìn)行克隆、表達(dá)和抗體制備后，通過(guò)免疫電鏡技術(shù)證實(shí)VP19和VP7

6、5是病毒的外囊膜蛋白。藥物抑制實(shí)驗(yàn)顯示，AraC可以抑制VP19和MCP的表達(dá)，證明VP19和MCP一樣，是SGⅣ的晚期轉(zhuǎn)錄本，與ATV和RGV的VP19同系物相同。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，VP19呈現(xiàn)與病毒加工廠共定的位特征；VP75則分布在病毒加工廠外?？贵w中和實(shí)驗(yàn)顯示，VP19抗體對(duì)病毒入侵具有強(qiáng)烈的抑制作用，VP75抗體對(duì)病毒入侵有一定的抑制作用，證明VP19和VP75可能在病毒入侵階段發(fā)揮重要作用。
　　 本研究中新建的細(xì)